一种人活性颗粒酶K重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人活性颗粒酶K重组蛋白（rhGzmK）的制备方法，该重组蛋白去除了人颗粒酶K（hGzmK）N端的24个氨基酸，并在C端增加了6个组氨酸，以方便用镍离子柱进行纯化。其流程是：抽提人NK92细胞的总RNA，利用RT-PCR技术得到hGzmK基因，将之与原核表达载体pET24a(+)相连，构建重组表达质粒pET24a(+)-hGzmK，经转化大肠杆菌BL21后获得工程菌，该工程菌经IPTG诱导可表达rhGzmK。该重组蛋白以包涵体的形式表达，可利用镍亲和层析柱进行纯化，其纯度可达95%以上。该方法具有操作简单、产量高、重组蛋白易于纯化等特点，且纯化蛋白具有较高的生物学活性。

Method for preparing human active granule enzyme K recombinant protein

The invention relates to a human active granzyme K recombinant protein (rhGzmK) of the preparation method, the recombinant protein from human granzyme K (hGzmK) 24 amino acids N terminal, and a 6 increase in histidine at C end, to facilitate the use of nickel ion column for purification. The process is: total RNA was extracted from NK92 cells, the hGzmK gene was obtained by RT-PCR technology, and the prokaryotic expression vector pET24a (+) to construct recombinant expression plasmid pET24a (+) -hGzmK was transformed into Escherichia coli BL21 for engineering bacteria, the bacteria can be induced by IPTG expression of rhGzmK. The recombinant protein was expressed in the form of inclusion bodies and purified by nickel affinity chromatography. The purity of the recombinant protein was over 95%. The method has the advantages of simple operation, high yield and easy purification of the recombinant protein, and the purified protein has high biological activity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，具体地涉及了一种人活性颗粒酶K重组蛋白的表达、纯化及其活性鉴定的方法。
技术介绍
颗粒酶是外源性的丝氨酸蛋白酶，来源于自然杀伤细胞(NK)和细胞毒淋巴细胞(CTLs)释放的细胞浆颗粒，在抗肿瘤和抗病毒感染过程中发挥重要作用。这些颗粒内含颗粒酶原及其它蛋白酶原如穿孔蛋白。目前已经发现的颗粒酶有11种，分别命名为颗粒酶Al。在人类发现了 5类颗粒酶，它们分别是颗粒酶A (GzmA)、颗粒酶B (GzmB)、颗粒酶H(GzmH)、颗粒酶 K (GzmK)和颗粒酶 M (GzmM)0GzmK属于丝氨酸蛋白酶家族成员。研究表明，GzmK在能够诱导肿瘤细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的方式与GzmA相似，都是通过caspase非依赖途径诱导细胞凋亡，该方式的特点是颗粒酶和穿孔素共同作用时可以直接导致胞内线粒体损伤，从而导致活性氧(ROS)水平上升、粗面内质网压力(RER stress)或形成单链DNA缺口等。除诱导细胞凋亡功能外，还有研究表明，GzmK在炎症反应中也具有重要作用。如GzmK能够诱导巨噬细胞释放IL-1 β ,并通过PAR受体(蛋白酶激活受体)胞外诱导人肺成纤维细胞释放IL-6、IL-8、MCP-1等。因此，获得具有活性的GzmK重组蛋白对于研究其生物学功能及临床应用具有重要的理论和实际意义。原核表达具是目前掌握的最为成熟的表达系统，其所需的成本相对比较低廉，能够在较短时间内获得基因表达产物，并且具有操作简便的特点。加之可以表达产物尾部加上His标签，能够与Ni2+亲和层析柱特异性结合，并易于被高浓度咪唑溶液洗脱，因而可以利用镍柱亲和层析法对目的蛋白进行分离和纯化。亲和层析纯化蛋白具有简单，快速，产物纯度高等优点，是实际应用效果最好的方法之一。`Z-Lys-SBzl是一种丝氨酸蛋白酶硫酯底物,被丝氨酸蛋白酶GzmK切割后,SBzl能够与DTNB反应显黄色，在405nm处具有最大吸收值。吸光值越高，说明蛋白活性越好，从而准确检测GzmK的活性水平。
技术实现思路
本专利技术提出了一种人活性颗粒酶K重组蛋白(rhGzmK)的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤:(1)获得hGzmK 的 cDNA ； (2)构建和鉴定重组表达载体pET24a(+)-hGzmK； (3 )重组质粒pET24a (+) -hGzmK转化大肠杆菌BL21 ； (4)hGzmK重组蛋白的表达和鉴定； (5 ) hGzmK重组蛋白的纯化； (6)hGzmK重组蛋白的活性鉴定。本专利技术rhGzmK的制备方法中，所述步骤(I)包括以下步骤:提取人NK92细胞中的总RNA，通过反转录获得cDNA，然后用特异PCR扩增获得约720 bp的hGzmK基因，引物序列如下:引物 1:5' - GGAATTCCATATGGAAATTATTGGAGGGAAAG ~3/ (划线部分为 Nde I 酶切位点，76-97);引物 2:5' - CCGCTCGAGATTTGTATGAGGC -3'(划线部分为 Xho I 酶切位点，780-792)。hGzmK 基因 PCR 扩增产物约 720 bp。本专利技术rhGzmK的制备方法中，所述步骤(2)包括以下步骤:将得到的hGzmK PCR产物与原核表达载体pET24a(+)分别进行Nde I和Xho I双酶切，酶切产物回收后于16 °C过夜连接，连接产物转化大肠菌DH5a后提取质粒并用Nde I和Xho I双酶切鉴定，获得表达载体 pET24a (+) -hGzmK。本专利技术rhGzmK的制备方法中，所述步骤步骤(3)中的转化是指:将所述重组质粒pET24a(+)-hGzmK加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，然后置于冰上冷却后进行热击；加入无抗生素培养基后培养60min，涂布于kan+ LB平板，经37 °C培养12_16h，得到hGzmK阳性转化子细菌。所述置于冰上时间是30min ;热击的条件为:水温42°C，时间90s ；无抗培养基加入体积比为1:3 ;恢复时间为60min。本专利技术rhGzmK的制备方法中，所述步骤(4)中的表达是指:将阳性转化子细菌PET24a(+)-hGzmK/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜；再接菌于新的LB培养基中，摇菌至0D600=0.6 0.8之间；然后在加入ImM IPTG诱导表达6h，12000rpm离心2min，去上清后，用PBS重悬菌体,沸水中煮样5min,收集上清得到所述rhGzmK。本专利技术rhGzmK的制备方法中，所述步骤(4)中的鉴定是指:将重组蛋白加样进行SDS-PAGE电泳并转膜后，以小鼠抗His多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，通过Western Blot鉴定所述rhGzmK的表达。本专利技术rhGzmK的制备方法中，所述步骤(5)中的包括以下步骤:将IPTG诱导表达所获得的PET24a(+)-hGzmK/BL21菌体离心后，用PBS重悬，然后置于超声波破碎仪中进行超声破碎；破碎后 ，于4°C, 12000rpm,离心15min,弃去上清，收集的沉淀用bindingbuffer (0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、5mM咪唑、10%甘油、8M尿素)，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45 μ m滤膜过滤。将过滤后的溶液通过预处理好的Ni2+柱进行亲和层析纯化,然后用binding buffer和washing buffer (0.5M NaCl>20mM Tis-HCl、60mM咪唑、10%甘油、8M尿素)重悬洗去未结合的杂质，最后用含高浓度咪唑的 elute buffer (0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、500mM 咪唑、10% 甘油、8M 尿素)使亲和力减弱，从而将rhGzmK洗脱下来。洗脱下来的buffer中含有高浓度尿素和咪唑，将其放入处理好的透析袋中进行透析，尿素和咪唑析出，袋中的蛋白即为高纯度的rhGzmK。本专利技术rhGzmK的制备方法中，所述步骤(6)中的活性鉴定是指:在缓冲液(50 mMTris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.01% Triton X-100 ；pH 7.6)中加入终浓度为 0.3mM 底物溶液Z-Lys-SBzl，混匀后加入96孔板中。在含底物溶液的96孔板中加入待测重组蛋白后，加入终浓度为0.3mM底物显色液5，5- 二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，作用10分钟后于酶标仪上读取405nm处OD值。本专利技术利用基因工程的方法构建了能够稳定表达人活性颗粒酶K重组蛋白的大肠杆菌工程菌，表达产物可以用镍层析柱进行纯化，且获得的纯化蛋白具有较好的生物学活性。本专利技术提供了一种制备人活性颗粒酶K重组蛋白的方法及纯化工艺，为获得具有生物学活性的人活性颗粒酶K重组蛋白提供了一种简单、高效的实验方法，有利于对人颗粒酶K进行结构和生物学功能的研究。附图说明图1为本专利技术方法中重组表达质粒PET24a(+)-hGzmK构建流程图；图2为hGzmK基因PCR扩增图谱，第一泳道为DL 2000分子量标准(自上向下依次为: 2000 bp, IOOObp, 750 bp, 500 bp, 250 b本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人活性颗粒酶K重组蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：a）获得hGzmK的cDNA提取人NK92细胞中的总RNA，用RT?PCR的方法获得cDNA，然后用特异PCR扩增获得hGzmK基因；b）构建和鉴定重组表达载体pET24a(+)?hGzmK将得到的hGzmK?PCR产物与原核表达载体pET24a(+)分别进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物回收后于16?℃过夜连接，连接产物转化大肠菌DH5α后提取质粒并用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到约720?bp条带，证明pET24a(+)?hGzmK重组质粒构建成功；c）重组质粒pET24a(+)?hGzmK转化大肠杆菌BL21转化是指：将所述重组质粒pET24a(+)?hGzmK加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，然后置于冰上冷却后进行热击；加入无抗生素培养基后培养60min，涂布于kan+?LB平板，经37℃培养12?16h，得到hGzmK阳性转化子细菌；d）hGzmK重组蛋白的表达和鉴定将所述阳性转化子细菌pET24a(+)?hGzmK/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜；再接菌于新的LB培养基中，摇菌至OD600=0.6~0.8之间；然后再加入IPTG诱导表达6h，12000rpm离心2min，去上清后，用PBS重悬菌体，沸水中煮样5min，收集上清得到rhGzmK；以小鼠抗His多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，通过Western?Blot鉴定所述rhGzmK的表达；其中：诱导表达的诱导剂IPTG终浓度为1mM；e）hGzmK重组蛋白的纯化将IPTG诱导表达所获得的pET24a(+)?hGzmK/BL21菌体离心后，用PBS重悬，然后置于超声波破碎仪中进行超声破碎；破碎后，于4℃、12000rpm，离心15min，检测到rhGzmK主要以包涵体的形式存在于沉淀中；弃去上清后，收集的沉淀用binding?buffer尿素溶液重悬，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45μm滤膜过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的Ni2+柱进行亲和层析纯化；f）hGzmK重组蛋白的活性鉴定在缓冲液中加入底物溶液Z?Lys?SBzl，混匀后加入96孔板中；在含底物溶液的96孔板中加入待测重组蛋白后，加入底物显色液5,5?二硫代双(2?硝基苯甲酸)（DTNB），作用10分钟后于酶标仪上读取405nm处OD值。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江文正，龙凤英，杜佳妮，陈冉，孔晓波，史亚茹，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：