本发明专利技术属分子生物学领域，涉及应用基因转染技术Grp75在制备治疗肝细胞氧化损伤和肝脏纤维化药物中的用途。本发明专利技术基于Grp75是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，其N端1-23位点为线粒体的穿膜信号，帮助蛋白正确折叠、协助蛋白质的转运，具有清除ROS、抗细胞凋亡的作用等特性，进行了Grp75对H2O2诱导的细胞氧化应激的细胞保护作用试验，和CCL4诱导下的肝纤维化为病理基础的动物模型的保护作用试验，在肝细胞发生损伤时，将GRP75的基因转入，分别在细胞和整体水平上使其上调表达，结果显示，通过Grp75蛋白的抗氧化损伤作用和抑制肝细胞凋亡的作用可达到治疗肝纤维化的效果。本发明专利技术的Grp75基因可制备治疗肝脏纤维化药物。
Use of Grp75 gene in preparing medicine for treating liver fibrosis
The invention belongs to the field of molecular biology, and relates to the application of gene transfection technology Grp75 in the preparation of medicine for treating liver cell oxidative damage and liver fibrosis. The method is based on the Grp75 is an important molecular chaperone of cytoplasm and mitochondria, the N site 1-23 for mitochondrial transmembrane signal, help protein folding and assist protein transport, with clear ROS, anti apoptotic effect and other characteristics, the Grp75 test cell protective effect on oxidative stress induced by H2O2 the test of protective effect of CCL4 induced hepatic fibrosis and the pathological basis of the animal model of injury occurred in the liver cells, the GRP75 gene, expression, which is upregulated in cells and the overall level were showed by the antioxidative effect of Grp75 protein and inhibit the apoptosis of hepatocytes can be to achieve the treatment effect of hepatic fibrosis. The Grp75 gene of the present invention can be used for preparing medicine for treating liver fibrosis.
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术属于分子生物学领域，涉及Grp75基因新的用途，具体涉及应用基因转染技术Grp75在制备治疗肝细胞氧化损伤和肝脏纤维化药物中的用途。
技术介绍
:肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应，表现为肝内结缔组织增生与沉积。现代研究表明，常见多发的急，慢性肝病例如病毒型肝炎，脂肪肝，酒精肝等大部分病例在早期均表现为肝纤维化，如果不能及时发现并有效抑制，将可能进一步发展成为肝硬化乃至肝癌，直接危及患者生命。据研究显示，正常肝细胞损伤被视为激活肝纤维化的最初信号，随着肝细胞的持续受损，凋亡，肝纤维化将不断加剧。因此，阻止或者延缓肝纤维化的发生，预期可治愈多数慢性肝病。研究报道，肝细胞的 氧化损伤的发生是肝纤维化的早期的病理过程，肝纤维化是肝脏内纤维结缔组织增生导致的慢性疾病，在肝纤维化的病理过程中，肝星形细胞的激活，是其显著的特征，而肝细胞的氧化损伤和凋亡往往是肝纤维化发生的始动因素。葡萄糖调节蛋白75(简称Grp75)是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，在缺糖、辐射等应激条件下，Grp75呈上调表达，以起到保护蛋白质，协助蛋白质(特别是线粒体蛋白质)转运，提高细胞对应激反应耐受性的作用。Grp75在缺糖损伤时通过减少ROS和脂质过氧化物的产生，以及增加 ATP 水平保护细胞。(YanLIU，WenLIU, XiaodongSONG, JiZU0.Effectof Grp75 over expression on intracellular ATP level, mitochondrialmembranepotential and ROS accumulation following glucose deprivation in PC12cells.Molecular and Cellular Biochemistry 2005, (268):45-51 ；Zuo J,Xia BI,Massa SM,etal.GRP75 is upregulated in ischemic brain..J.Neurochem.1996,67:S33A.)同时GRP75能通过阻止Bax构象改变、延迟Cyt C释放抑，调控Raf/Mek/Erk途径等细胞凋亡通路，从而对缺糖等应激造成的细胞凋亡起到抑制作用。P53蛋白的C端312 352氨基酸残基处具有Grp75结合信号，Grp75与p53发生结合，可抑制p53移位到线粒体和核，继而分别抑制了 P53介导的线粒体凋亡途径和转录依赖性凋亡途径。所以Grp75可以通过多种作用机制抑制细胞凋亡，对细胞损伤起到保护作用。(Wadhwa R, Takano S, Kaur K, DeocarisCC, Pereira-Smith 0M, Reddel RR, Kaul SC.Upregulation of mortalin/mthsp70/Grp75contributes to human careinogenesis.1nt J Cancer.2006 Jun 15 ；118 (12):2973-80.)Grp75在心脏、脑、肺、脾等多种组织中有构成性表达，当细胞损伤发生时，伴侣分子Grp75可以应激性上调，起到细胞保护效应，抑制细胞凋亡进程。然而Grp75在肝组织中却没有构成性表达(李华，杨增杰，夏蓓莉，左伋.葡萄糖调节蛋白75的表达特性..复旦学报(医学科学版)，2001,28 (5):382)，如何在肝细胞发生损伤时，我们将GRP75的基因转入，分别在细胞和整体水平上上使Grp75上调表达，进一步产生其抗氧化损伤作用和抑制肝细胞凋亡的作用已引起有关领域研究者的关注。
技术实现思路
:本专利技术的目的是提供Grp75基因新的用途，具体涉及Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途。尤其涉及Grp75对肝细胞的过氧化氢造成的损伤保护作用和Grp75对由CCL4S导的肝纤维化的治疗作用。具体的，本专利技术采用7702细胞进行细胞实验，通过加入H202 (400umol/ml)的DMED培养基建立肝细胞氧化损伤模型，用MTT法检测正常组和Grp75上调组在给予氧化损伤的细胞存活率影响；用赖式法检测AST，ALT等血清学指标，用荧光探针标记ROS和线粒体跨膜电位用荧光显微镜观察其变化；采用以CCL4腹腔注射法制作大鼠肝纤维化模型，将Grp75基因转入动物，鉴定证实Grp75在肝脏中上调表达，以病理学、组织中线粒体功能(ATP生成、CytoC)和血清中AST, ALT的变化，观察Grp75对模型动物的治疗作用；实验结果表明，上调Grp75能通过线粒体保护作用，缓解细胞氧化损伤，抑制肝细胞凋亡，从而减缓肝纤维化发展的进程，达到对肝纤维化的治疗效果。更具体地本专利技术的目的通过下述技术方案实现: 1.建立细胞氧化损伤模型，其中包括:7702细胞常规培养；加入H2O2建立7702细胞氧化损伤模型；用MTT比色法鉴定7702细胞H2O2氧化损伤模型；2.Grp75基因转入7702细胞，其中包括:构建Grp75上调质粒；脂质体转染法将Grp75基因转入7702细胞；Western blot检测细胞内GRP75表达；3.Grp75转基因保护细胞氧化损伤，其中包括:细胞培养与分组；赖氏法检测细胞内AST，ALT水平；用荧光探针标法检测线粒体活性氧(Reactive oxygen species, R0S)的生成；用突光探针标法检测线粒体膜电位(mitochondria membrane potential, MMP);用虫突光素酶法检测细胞内腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate, ATP)；4.动物肝纤维化模型建立，本专利技术的实施例中优选建立CCL4诱导大鼠肝纤维化模型；5.GRP75转基因治疗大鼠肝纤维化，其中包括:构建Grp75上调质粒；将质粒用转染试剂转入大鼠；免疫组化和Western blot观察GRP75转入大鼠后的表达量；6.Grp75转基因治疗作用观察，其中包括:动物肝组织病理切片观察；AST，ALT等血清学指标检测；ATP线粒体腺嘌呤核苷三憐酸(adenosine triphophate)检测；Western blot检测细胞色素C表达。本专利技术提供了 Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途；尤其是Grp75对肝细胞的过氧化氢造成的损伤保护作用和Grp75对由CCL4诱导的肝纤维化的治疗作用。本专利技术基于Grp75是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，其N端1_23位点为线粒体的穿膜信号，帮助蛋白正确折叠、协助蛋白质的转运，具有清除R0S、抗细胞凋亡的作用等特性，进行了 Grp75对H2O2诱导的细胞氧化应激的细胞保护作用试验，和CCL4诱导下的肝纤维化为病理基础的动物模型的保护作用试验，在肝细胞发生损伤时，将GRP75的基因转入，分别在细胞和整体水平上使其上调表达，结果显示，通过Grp75蛋白的抗氧化损伤作用和抑制肝细胞凋亡的作用可达到治疗肝纤维化的效果。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种本文档来自技高网...
【技术保护点】
Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘雯，左伋，鄂裘恺，刘平，
申请(专利权)人：复旦大学，上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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