尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法技术

尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，包括：向尿液样品加入rac-NNAL-甲基-d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,0.6M）和β-葡糖苷酸酶混匀后置入微波辅助萃取仪中在37℃恒温酶解,再将酶解后的尿样经过MIP-NNAL固相萃取小柱净化，减压浓缩至干，加入三乙基胺无水乙腈溶液、(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，衍生化后再对样品进行GC-MS-MS分析，进而换算出尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量。本发明专利技术提供了一种检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确的尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的分析检测方法，填补了这一技术领域的空白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于烟草特有亚硝胺在尿液中的生物标志物理化检验
，具体涉及尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法。
技术介绍
近年来，人们对吸烟与健康问题越来越重视，因此国内外对烟气中的各种有害化学成分的研究越来越深入。经过多年研究，国际癌症研究机构(IARC)等的毒性评价结果认为:烟草特有亚硝胺中的4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)对动物有致癌性，NNK和它的代谢物是潜在的肺癌致癌物。因此，现在烟草行业内外迫切需要建立一种准确评价不同人群对NNK暴露程度的方法，而生物标志物法是一种公认且有效的监测NNK暴露人群暴露程度的方法。到目前为止，众多烟草科技工作者的长期研究证明，在吸烟者的尿液中未检测到NNK, NNK在人体和实验室动物体内的主要代谢物是4-(甲基亚硝胺基)-1-( 3-吡啶基)_1_ 丁醇(NNAL)和 NNAL 糖苷化合物(包括 NNAL-O-Glucuronide 和 NNAL-N-Glucuronide),这些代谢产物主要通过尿液和其它体液排出体外。虽然烟草和卷烟烟气中的NNK有致癌性，但它在人体中的主要代谢产物NNAL的毒性显著降低，NNAL糖苷化以后毒性进一步降低。在生物代谢样品分析中，由于尿样容易获得，又可以有效反映NNK的暴露情况，所以一直成为研究热点。现在，检测尿液中的NNAL和NNAL糖苷化合物已经成为一种检测吸烟者、无烟气烟草制品消费者和被动吸烟者暴露于NNK的常用接触生物标志物。NNK分子中没有手性碳原子，因此NNK分子没有对映异构体，但NNK分子中有一个羰基，该羰基随着NNK进入人体后被羰基还原酶还原为羟基，生成一对NNAL对映异构体，分别为(S)-NNAL和(R)-NNAL。2002年，Hecht等的研究发现揭示，人尿样中游离形式的(R)-NNAL的含量略约是(S)-NNAL含量的1.1倍，但人尿样中(R)-NNAL糖苷化合物的含量是(S) -NNAL糖苷化合物含量的的两倍左右，这说明(S) -NNAL和(R) -NNAL的进一步代谢途径差别很大，人体代谢排出(S)-NNAL的速度远低于排出(R)-NNAL的速度，同时也说明人体对(S) -NNAL有一种立体选择性的保留能力，特别是老鼠在摄入NNK后相当长一段时间内其肺部(S)-NNAL的比例也远高于(R)-NNAL。其他学者的研究结果也显示吸烟的肺癌患者尿样中(S)-NNAL与(R)-NNAL的比值明显大于普通吸烟者。结合流行病学调查分析结果，人们推测人肺脏内可能有(S)-NNAL的受体，此受体可特异性结合(S)-NNAL，这可能就是吸烟吸收NNK导致肺癌的原因之一。由于卷烟烟气中的NNK释放量只有几个纳克每支卷烟，而NNK进入人体后又被代谢为多种物质，加之尿样基质复杂，所以尿样中的⑶-NNAL和(R)-NNAL的检测非常困难，国内外许多相关行业都无法开展尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测工作。在这种背景下，许多相关行业迫切需要建立一种能够快速准确测定人体尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量和比例的方法，以便为肺癌的早期检测等提供进一步参考信息。针对现有技术的不足，本专利技术提供的尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，具有检测限低、速度快、准确度和灵敏度高、成本低廉的特点，适用于各种人体尿液常见样本中的⑶-NNAL和(R) -NNAL的检测，因此该方法对于检测尿液中的⑶-NNAL和(R) -NNAL的含量以及评估人体对烟气中NNK的暴露程度具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有方法很难开展尿样中⑶-NNAL和(R) -NNAL的检测工作的不足，提供一种尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，为评估个体对烟气中NNK的暴露程度提供一种科学的判定方法，该方法具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确等优点。本方法适用于尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测，为一种科学评估个体对烟气中NNK的暴露程度的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现:尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法,包括以下步骤:①用测定旋光并比对的方法确定⑶-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照，或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3-⑶-(+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照；②配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基_d3的混合标准溶液，再用(S)-(+)_a-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺的无水乙腈溶液衍生化，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS-MS分析；用确定构型后的⑶-NNAL-(S)-(+)_a-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S) - (+) - a -甲氧基-a-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应的色谱峰保留时间，并建立⑶-NNAL-(S)-(+)-a-甲氧基-a-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL-(S)-⑴-a-甲氧基-a-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线；③将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，加入rac-NNAL-甲基_d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶液(PH6.4，0.6M)和β -葡糖苷酸酶，充分混匀后置入微波辅助萃取仪中在37°C恒温酶解，再将酶解后的尿样上样到MIP-NNAL固相萃取小柱净化，淋洗后用二氯甲烷洗脱，加入无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入三乙基胺无水乙腈溶液、(S)-(+)_a-甲氧基-α -三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，盖紧，衍生化后立即对样品进行GC-MS-MS分析。所述的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法,其中分析检测尿样中尿液中(S) -NNAL和(R) -NNAL时进行Mosher衍生化。所述的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法中，使用微波辅助萃取仪在37°C对尿样进行恒温酶解。具体实施例方式以下结合应用实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不限定本专利技术的保护范围。实施例1:除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为重量百分数。尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，包括以下步骤:1.化学试剂(S)-(+)-a-甲氧基-a -三氟甲基苯乙酰氯(CAS号20445-33-4)，(S)-(+)-a—甲氧基-(三氟甲基)苯乙酸酐(CAS号85541-57-7),4-(-甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-丁醇(NNAL) (rac NNAL, CAS 号 76014-81-8)，4-(甲基-d3_ 亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(rac-NNAL-甲基 _d3CAS 号 1020719-61-2)，三乙基胺，β-葡萄糖甘酸酶(类型ΙΧ-Α，来自大肠杆菌)(S) -NNAL和(R) -本文档来自技高网...

【技术保护点】
尿液中(S)?NNAL和(R)?NNAL的气相色谱?质谱?质谱联用检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：①用测定旋光并比对的方法确定(S)?NNAL和(R)?NNAL的构型并作为参照，或用Mosher方法确定(S)?NNAL?(S)?(+)?α?甲氧基?α?三氟甲基苯乙酸酯和(R)?NNAL?甲基?d3?(S)?(+)?α?甲氧基?α?三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照；②配制含有rac?NNAL和氘代rac?NNAL?甲基?d3的混合标准溶液，再用(S)?(+)?α?甲氧基?α?三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺的无水乙腈溶液衍生化，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行GC?MS?MS分析;用确定构型后的(S)?NNAL?(S)?(+)?α?甲氧基?α?三氟甲基苯乙酸酯和(R)?NNAL?(S)?(+)?α?甲氧基?α?三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应的色谱峰保留时间，并建立(S)?NNAL?(S)?(+)?α?甲氧基?α?三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和(R)?NNAL?(S)?(+)?α?甲氧基?α?三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线；③将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，加入rac?NNAL?甲基?d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,0.6M）和β?葡糖苷酸酶，充分混匀后置入微波辅助萃取仪中在37℃恒温酶解,再将酶解后的尿样上样到MIP?NNAL固相萃取小柱净化，淋洗后用二氯甲烷洗脱，加入无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入三乙基胺无水乙腈溶液、(S)?(+)?α?甲氧基?α?三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，盖紧，衍生化后立即对样品进行GC?MS?MS分析。...

【技术特征摘要】
1.尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤: ①用测定旋光并比对的方法确定(S)-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照，或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3- (S) - (+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照； ②配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液，再用(S)-(+)_a-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺的无水乙腈溶液衍生化，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS-MS分析；用确定构型后的⑶-NNAL-(S)-(+)_a-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S) - (+) - a -甲氧基-a-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应的色谱峰保留时间，并建立⑶-NNAL-(S)-(+)-a-甲氧基-a -三氟甲基苯乙酸酯的标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋举兴，段焰青，王明锋，夏建军，王文元，史小波，
申请(专利权)人：红云红河烟草集团有限责任公司，
类型：发明
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