亚洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种全新的亚洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的基因核苷酸序列，以及该序列所编码的蛋白质的氨基酸序列，在获得目的基因片段的基础上，构建了OfOGA基因的pET-28a(+)重组表达载体，并将其转化至大肠杆菌宿主细胞中表达OfOGA蛋白，培养用该质粒所转化的宿主细胞，经过筛选得到阳性菌株；培养菌株，诱导蛋白表达；分离并纯化所表达的蛋白，将其应用于开发绿色农药领域，也可设计小分子化合物应用于医疗，用于开发一些治疗疾病(阿尔茨海默病和糖尿病)的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及亚洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的基因、含有该基因的表达载体的构建、该基因在原核宿主细胞中的蛋白表达及其应用。
技术介绍
随着技术的发展，越来越多的O-GlcNAc修饰的蛋白被发现。其中，dbOGAP数据库(http://cbsb.lombard1.georgetown.edu/OGAP.html)提供了来源不同物种的经O-GlcNAc修饰的蛋白及其修饰位点。这种O-GlcNAc修饰作用仅有两种酶调控:0_GlcNAc转移酶(OGT)及O-GlcNAc水解酶(OGA)。生物体内一些重要蛋白O-GlcNAc修饰作用的异常会引起生理功能的紊乱甚至造成机体死亡。早前的研究发现人大脑的Tau蛋白的O-GIcNAc水平的降低会引起其高磷酸化，进而引起阿尔茨海默病；线虫中daf蛋白的高O-GlcNAc会造成胰岛素信号衰弱现象；果蝇中Akt的高Ο-GlcNAc水平会加强胰岛素样信号通路。这些研究主要是基于基因水平，通过干涉 OGT或OGA抑制其基因的表达来反映Ο-GlcNAc水平变化对于机体的影响。然而，通过基因敲除的手段往往引起一些其他正常基因的表达异常，造成不必要的麻烦。因此，从蛋白出发，根据其特殊的理化性质，用分子的方法来监控体内重要蛋白的O-GlcNAc水平显得格外重要。亚洲玉米螟作为我国主要的农药害虫之一，它的预防及防治十分困难。目前尚没有特效的化学农药，而且由于其钻蛀特性，施药方法也费时费力。蛋白O-GlcNAc修饰作用无论在哺乳动物还是昆虫中都是十分重要的，如果根据亚洲玉米螟β -N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的结构信息，设计靶标小分子，从而影响亚洲玉米螟的生长发育，无论是研究价值还是商业价值都是巨大的。由于OGA的序列相似性比较低，因此基因获取难度大，关于它的相关基因报导情况很少，其相关的重组表达更是屈指可数。因此本专利致力于获得全新OGA的基因，并进行重组表达，通过对其蛋白性质的鉴定及后续晶体的获得来研发小分子化合物，来调节机体内靶蛋白的O-GlcNAc水平。
技术实现思路
本专利技术公开了一种全新的β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的基因核苷酸序列，以及该序列所编码的蛋白质的氨基酸序列，在获得目的基因片段的基础上，构建了OfOGA基因的重组表达载体，并将其转化至大肠杆菌宿主细胞中表达OfOGA蛋白，将其应用于开发绿色农药领域，也可设计小分子化合物应用于医疗，用于开发一些治疗疾病(阿尔茨海默病和糖尿病)的药物。本专利技术具体通过以下技术方案实现，本专利技术的一方面在于:一种亚洲玉米螟β -N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 17所示。本专利技术的另一方面在于:上述的β -N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因所编码的蛋白质，其氣基酸序列为SEQ ID Ν0:18所不。本专利技术的另一方面在于:上述的β -N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因的重组表达载体。具体的，上述的重组表达载体为大肠杆菌表达载体pET_28a(+)。本专利技术的另一方面在于:由上述重组表达载体所转化得到的重组菌株。本专利技术的另一方面在于:上述重组菌株制备亚洲玉米螟β -N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶的方法，包括如下步骤:设计引物扩增上述OfOGA基因；构建含有上述OfOGA基因的表达质粒；培养用该质粒所转化的宿主细胞，经过筛选得到菌株；培养菌株，诱导蛋白表达；分离并纯化所表达的蛋白。本专利技术的另一方面在于:上述亚洲玉米螟β -N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶蛋白在农药、医药领域的应用。有益效果:本专利技术首先解决了亚洲玉米螟的β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的基因序列获取问题，还是首例解决了昆虫来源的OGA的重组表达问题。所获得的重组菌株能大量表达OfOGA。另外，针对该酶的抑制剂还可作为对亚洲玉米螟的防治策略，从而达到对目标害虫的防治，同时基于其结构的研究也可设计小分子化合物应用于医疗，用于开发一些治疗疾病(阿尔茨海默病和糖尿病)的药物。附图说明图1:从5龄的亚洲玉米螟幼虫中提取的总RNA的凝胶电泳分析图；图2:of-l的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图3 #未知序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图4 W未知序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图5:利用0f-4-Fl/0f-4_Rl弓丨物扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图6:利用0f-5-Fl/0f-5_Rl弓丨物扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图7:全长OfOGA基因产物琼脂糖凝胶电泳具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。亚洲玉米螟5龄幼虫(Ostrinia furnacalis),由中国农业科学院植物保护研究所赠与。下述实施例中涉及到使用试剂盒的实验操作，均按照试剂盒说明书进行操作。实施例1亚洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)基因的获得一、亚洲玉米螟5龄幼虫的total RNA提取 使用RNAiso plus (大连宝生物公司，Code N0.D9108A)对亚洲玉米螟5龄幼虫进行总RNA提取，获得其总RNA。取Iul上述亚洲玉米螟总RNA进行I %琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，图1所示为从5龄的亚洲玉米螟幼虫中提取的总RNA的凝胶电泳分析，其中两个RNA样品，结果清晰，均符合质量要求适合下一步实验。二、RT-PCR 实验以亚洲玉米螟5龄幼虫总RNA为模板，进行反转录，合成cDNA。根据软件设计亚洲玉米螟OfOGA基因调取及克隆所用引物，并送至大连宝生物公司合成。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚洲玉米螟β?N?氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ?ID?NO：17所示。

【技术特征摘要】
1.一种亚洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因，其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID NO:17所示。2.权利要求1所述的β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因所编码的蛋白质，其氣基酸序列为SEQ ID Ν0:18所不。3.含有权利要求1所述的β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于:重组表达载体为大肠杆菌表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨青，周罡，杨君，姜秀萍，刘田，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：