合成和纯化寡聚物的新方法技术

用于寡核苷酸合成或纯化的试剂，其中所述试剂具有结构：X-C-L-H(式A)其中X是亚磷酰胺基、H-膦酸酯基、缩醛基、或异氰酸酯；C-是直接的键或者由-Ca-Cb-表示的可裂解的接头；L是烃基链；并且H为端基炔或活化的环辛炔。式(A)的试剂可以用于合成和纯化寡核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
专利技术背景专利
本专利技术总体上涉及寡核苷酸的试剂、合成和纯化领域。
技术介绍
寡核苷酸是短链核酸聚合物，典型地含有几个至几百个核苷酸。它们是基因组研究和生物技术的重要工具。虽然寡核苷酸可以通过较长前体的分裂产生，但是现在它们更通常是由单体以序列特异性的方式合成。它们典型地是在固体载体上使用亚磷酰胺化学或磷酸酯化学合成。附图说明图1A显示了一个 使用亚磷酰胺的固相寡核苷酸合成的典型合成循环。四个主要步骤包括:1)脱三苯甲基化；2)偶联；3)封端；和4)氧化。如图1中所示，第一核苷酸被化学键合到固体载体(例如，可控孔度玻璃珠(controlled pore glass bead))上。这些可以以预键合到固体载体上的第一核苷酸的形式从商业来源购买。要启动合成，使用温和的酸(例如，惰性溶剂如二氯甲烷或甲苯中2%或3%的三氯乙酸)将第一核苷酸的5,-羟基的保护基团(常用的5,-羟基的保护基团是三苯甲基(B卩，-C(Ph)3)或4，4' - 二甲氧基三苯甲基，其可以缩写为DMT，DMTr)除去。然后，将具有3’ -亚磷酰胺基团(例如，3' -O- (2-氰乙基-N-N- 二异丙基)亚磷酰胺)的5' -DMTr保护的第二核苷酸偶联到固体载体上的第一核苷酸上游离的5,-羟基基团上。该偶联可以通过使用酸性唑催化剂(例如，IH-四唑)在乙腈中活化亚磷酰胺而实现。然后将活化的亚磷酰胺与游离的5'-羟基反应，以形成亚磷酸三酯链接(linkage)。因为偶联反应的效率永远不会是100%，所以一些游离的5'-羟基将会保留。使用乙酸酐和酰化催化剂(例如N-甲基咪唑)将任何未反应的5'-羟基封端，以防止失败序列(failure sequence)在下一个循环中反应。封端之后，将亚磷酸三酯氧化，从而将它转化成磷酸酯链接。氧化可以用碘在弱碱(例如吡啶)的存在下完成。这些步骤完成了第一偶联循环。所述方法可以重复多个循环直到合成了期望的寡核苷酸。类似的方法在图1B中示出，其使用了 H-膦酸酯单体代替亚磷酰胺。除了仅需要一个氧化步骤并且是在合成结束时进行之外，大部分步骤是类似的。在链延长完成时，寡核苷酸仍附着在固体载体上并且完全被保护。为了提供功能性的寡核苷酸，需要除去保护基团并且需要将寡核苷酸产物从固体载体上释放。这些可以使用碱溶液(例如氢氧化铵或甲胺水溶液)以及可能的其它预处理步骤(例如2-氰乙基保护基团的脱保护)完成。上述合成步骤可用于DNA或RNA寡聚物的合成。然而，对于RNA的合成，2’-羟基需要用耐受反应条件的基团进行保护。典型的2’-羟基的保护基团包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM) ο通常，偶和步骤不会100%完成。未完成的反应导致短链体(short-mer)的形成。如上提到的，短链体典型地使用试剂例如乙酸酐进行封端，以防止它们在反复的固相合成中生长。这通常导致产生寡聚物池，所述寡聚物池由短链体(n-l、n-2、n-3等聚体)和期望的全长产物组成。图2的(A)和(B)分别显示了 HPLC色谱和PAGE分析，以证明产物是含有一些失败序列的混合物的事实。来自寡核苷酸合成的产物总是含有失败序列(较短的寡核苷酸，大部分是η-1聚体)。传统上使用HPLC或硅胶电泳例如PAGE纯化这些粗产物。虽然这些方法对于纯化短寡核苷酸是可以接受的，但是对于纯化较长的寡核苷酸(例如50-300聚体)却是不能接受的。另外，这些方法可能是昂贵并且耗时的，可能消耗大量的溶剂并且可能仅限于熟练的的专业人员使用。为了促进寡核苷酸的合成和纯化，已经专利技术了替代的方法，例如使用合成纯化处理以绕过HPLC或PAGE的使用。这些替代方法的例子包括亲氟萃取(Belier，C.；Bannwarth, ff., Noncovalent Attachment of Nucleotides by Fluorous-FluorousInteractions !Application to a simple Purification Principle for Synthetic DNAFragments, Helv.Chim.Acfa2005，88，第 171-179 页；W02006/081035A2)，生物素-抗生物素蛋白实现的亲和萃取(Fang, S.；Bergstrom, D.E., Reversible Biotinylation ofthe 5' -Terminus of Oligodeoxyribonucleotides and its Application in AffinityPurification, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons,Inc.2001 ；Fang, S.；Bergstrom, D.E., Reversible5' -endBiotinylation and AffinityPurification of Synthetic RNA, Tetrahedron Letters2004,45 (43), 7987-7990),以及通过 Diels-Alder (W02003/062452A2)和聚合(美国专利公布 N0.2008/0081902AI)的基于反应的萃取方法。基于亲和的方法(即，氟亲和萃取和生物素-抗生物素蛋白方法)需要复杂的合成以产生带标记的寡核苷酸把手(handle)，这可能是昂贵的。在氟亲和萃取的情况下，含氟磷酸化试剂偶联得太慢而不用作长链寡核苷酸合成的封端试剂。对于作为最后单体的用途来说，5’-DMTr氟修饰的亚磷酰胺单体微溶于乙腈，偶联得慢且低效。它们还需要最终的酸性处理，这可能会导致脱嘌呤化并且影响长链寡核苷酸的完整性。这种方法还需要氟相亲和柱，其增加了复杂性和成本，并且可能不适于高通量或大规模纯化。生物素-抗生物素蛋白实现的亲和萃取还没有广泛地使用，并且从未用作封端试剂来诱捕失败序列。因为生物素本身的成本，制造生物素磷酸化试剂或者5’修饰的亚磷酰胺单体是昂贵的。此外，生物素亚磷酰胺(磷酸化试剂和单体)不是特别溶于乙腈并且推荐的偶联时间较慢(即约15分钟)。因此，它们不适于作为封端试剂。另外，这些方法还没有显示出适用于长链寡核苷酸。同时，这些方法依赖于生物素对链霉亲和素珠子的亲和力，这在高通量或大规模平台上是昂贵的。由于基于亲和的方法的成本和其它问题，人们已经试验了代替的方法，例如基于反应的方法。这些方法包括使用Diels-Alder和聚合的那些方法。在Diels-Alder方法中，使用二烯磷酸化试剂封端截短的序列，所述序列然后可能通过与含顺丁烯二酰亚胺的固体载体的4+2环加成而被拉出产物混合物。在实践中，这种方法仅限于纯化短链寡核苷酸(小于20聚体)并且由于低效的反应最终产率和纯度 较低。试剂封端截断的(失败的)序列。在完成合成之后，引发自由基聚合以形成聚合物，其然后可以与全长产物分离。丙烯酰胺亚磷酰胺单体也已经被用作链中的最后的核苷酸，并且全长产物可以通过自由基聚合而被诱捕，由此将它们与短链聚体分离，所述短链聚体中不含有丙烯酰胺部分。再一次地，这种方法对于(例如小于20聚体的)短本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于寡核苷酸合成或纯化的试剂，其中所述试剂具有如下结构：X?C?L?H(式A)其中，X是亚磷酰胺基、H?膦酸酯基、缩醛基、或异氰酸酯；C是直接的键或者可裂解的接头，其中所述可裂解的接头由?Ca?Cb?表示，其中Ca与X连接并且是直接的键、烃基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、核苷，其各自任选地被一至两个取代基所取代，所述取代基选自卤素、羟基、(C1?C6)烷氧基、(C1?C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的键、硅烷基、三苯甲基或邻位醇基；L是烃基链，其可以任选地被一至四个取代基所取代，所述取代基独立地选自由5至9元杂芳基、4至9元杂环基、氨基、醚、羧基、氨基甲酰基、(C6?C12)芳基、?O?R”、?O?CO?R”、?NR’?R”、?NR’?CO?R”、?CO?NR’?R”、?CO?R”、?CN、卤素或它们的组合所组成的组，其中R’和R”独立地为H或(C1?C6)烃基；或者L是其中插入了其它原子的烃基链，如?(CHR’)a?Wb?(CHR’)c?Vd?(CHR’)e?所示，其中W和V独立地为?O?、?S?或?NR’?；R’为H或(C1?C6)烷基；并且a、b、c、d和e独立地为0至10的整数；并且H为端基炔或活化的环辛炔。...

【技术特征摘要】
2011.11.30 US 61/565,4651.用于寡核苷酸合成或纯化的试剂，其中所述试剂具有如下结构:X-C-L-H (式 A) 其中， X是亚磷酰胺基、H-膦酸酯基、缩醛基、或异氰酸酯； C是直接的键或者可裂解的接头，其中所述可裂解的接头由-Ca-Cb-表示，其中Ca与X连接并且是直接的键、烃基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、核苷，其各自任选地被一至两个取代基所取代，所述取代基选自卤素、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；cb是直接的键、硅烷基、三苯甲基或邻位醇基； L是烃基链，其可以任选地被一至四个取代基所取代，所述取代基独立地选自由5至9元杂芳基、4至9元杂环基、氨基、醚、羧基、氨基甲酰基、(C6-C12)芳基、-O-R”、-O-CO-R”、-NR，-R，，、-NR，-CO-R”、-CO-NR，-R，，、_C0-R”、-CN、卤素或它们的组合所组成的组，其中R，和R”独立地为H或(C1-C6)烃基；或者L是其中插入了其它原子的烃基链，如_(CHR’)a-Wb-(CHR’ )c-Vd-(CHR> )e-所示，其中W和V独立地为-0-、-S-或-NR’ -;R’为H或(C1-C6)烷基；并且a、b、C、d和e独立地为O至10的整数；并且 H为端基炔或活化的环辛炔。2.根据权利要求1所述的试剂，其中H为活化的环辛炔基。3.根据权利要求1所述的试剂，其中C由-Ca-Cb-表示，其中Ca与X连接并且是直接的键、(C「C12)烃基、(C6-C12)芳基、5至12元杂芳基、(C3-C12)环烷基、4-12元杂环基、核苷，其各自任选地被一至两个取代基所取代，所述取代基选自卤素、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、氨基或烷氨基；Cb是直接的键，硅烷...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰里米·拉基，艾米丽·马林·勒普鲁，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：