本发明专利技术公开了一种特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子及其应用。本发明专利技术所提供的标准分子为环状载体，包括如序列1的第10-101位所示的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段、如序列1的第256-336位所示的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段、如序列1的第191-258位所示的水稻内源基因GOS片段，以及如序列1的第108-184位所示的Ti质粒T-DNA的边界序列片段。实验证明，本发明专利技术所提供的标准分子具有较高的灵敏度，其最低检测线可达2拷贝，线性范围广，均匀性好，稳定性强，对于转基因水稻品系科丰6号的定性和定量检测具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子及其应用。
技术介绍
水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，是世界上食用人口最多、历史最悠久的农作物。随着生物技术的发展，转基因技术正广泛地应用于农作物品质改良，已有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。科丰6号是转双价抗虫基因的转基因水稻品系，所导入外源基因是Bt/CpTI。在转基因检测时，必须使用标准物质作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准确检测。标准质粒分子是近几年发展起来的一种可替代植物基因组的一种重组质粒分子，一般包括物种特异性片段和转基因作物检测的外源基因或品系特异性片段。优点是生产成本低，质粒DNA的纯度高，产量大，制作和应用更为灵活，可以人为设计携带多个外源基因，使其应用更为广泛。目前，已经成功应用于转基因大豆棉花和玉米等的定量检测，而且目前标准质粒分子已经获得了国际协同认证。目前尚未有针对转基因水稻品系科丰6号进行特异性检测的质粒标准分子的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子及其应用。 本专利技术所提供的特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子具体为环状载体。所述环状载体具体包括豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因(CpTI基因)片段、苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因(Bt基因)片段、水稻内源基因GOS片段，以及Ti质粒T-DNA的边界序列(如右边界序列RB)片段。在本专利技术中，所述豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段的序列具体可如序列表中序列I的第10-101位所示；所述苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段的序列具体可如序列表中序列I的第265-336位所示；所述水稻内源基因GOS片段的序列具体可如序列表中序列I的第191-258位所示；所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段的序列具体可如序列表中序列I的第108-184位所示。进一步，所述环状载体为将所述豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段、所述苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段、所述水稻内源基因GOS片段、所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段一同与PEASY-T3质粒相连后得到的重组载体。更加具体的，所述环状载体为将如序列表中序列I所示的DNA片段与所述PEASY-T3质粒连接所得的重组载体。所述环状载体在作为标准分子检测转基因水稻品系科丰6号中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个目的是提供一种定性或定量检测转基因水稻品系科丰6号的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒，具体由所述环状载体和如下(al)_ (a4)中的全部或部分组成:(al)由序列表中序列2和序列3所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列4所示的探针；(用于扩增CpTI基因片段)(a2)由序列表中序列5和序列6所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列7所示的探针；(用于扩增Bt基因片段)(a3)由序列表中序列8和序列9所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列10所示的探针；(用于扩增水稻内源标准基因GOS片段)(a4)由序列表中序列11和序列12所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列13所示的探针。(用于扩增RB片段)以上(al)_ (a4)中，所述探针可为TaqMan荧光探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭荧光基团连接在探针的3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； 0 扩增时3&(1酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和 淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。所述报告荧光基团可为Fam (FAM)、Hex (HEX)、Tet (TET)、Joe (JOE)、Vic (VIC)、Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或 Cy5 (CY5)。所述淬灭荧光基团可为 Tamra (TAMRA)、Rox (ROX)、Dabcy (DABCY) ,Bhql (BHQl)或Bhq2 (BHQ2)。在本专利技术中，所述探针5’端标记的报告荧光基团具体为FAM荧光基团，3’端标记的淬灭荧光基团具体为TAMRA荧光基团。所述试剂盒在作为标准体系检测转基因水稻品系科丰6号中的应用也属于本专利技术的保护范围。制备所述试剂盒的方法也属于本专利技术的保护范围。该方法具体可包括如下步骤:将所述试剂盒中的所述环状载体、各引物对和各探针分别单独包装。本专利技术所提供的特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子包含外源基因CpTI和Bt、内参基因GOS及边界序列部分区段。实验证明，本专利技术所提供的标准分子具有较高的灵敏度，其最低检测线可达2拷贝，线性范围广，均匀性好，稳定性强，对于转基因水稻品系科丰6号的定性和定量检测具有重要意义。附图说明图1为标准分子PEASY-KF6质粒阳性克隆的PCR筛选结果。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准；泳道I为阳性对照；泳道2_24为23个标准分子pEASY_KF6质粒克隆。图2为标准分子pEASY-KF6的质粒构建图。实际上，对于插入片段，在“CpTI基因”前还有GCG-Hind III ;在“Bt基因”后还有Xba 1-GCG0图3为各引物和探针特异性检测结果。其中，A为外源基因CpTI的特异性检测结果:1表示转基因水稻品系科丰6号(GMO+) ；B为外源基因Bt的特异性检测结果:1表示转基因水稻品系科丰6号(GM0+)，2表示转基因水稻品系Bt63，3表示转基因棉花(转Bt抗虫基因)品系中棉41 ;C为内参基因GOS的特异性检测结果:1表示转基因水稻品系科丰6号(GM0+)，2表示非转基因水稻品系明恢86 (GM0-)，3表示转基因水稻品系Bt63 ；D为边界序列(品系特异性)的特异性检测结果:1表示转基因水稻品系科丰6号(GM0+)。图4为标准体系的灵敏度及标准曲线测定。其中，a为外源基因CpTI的灵敏度及标准曲线测定；b为外源基因Bt的灵敏度及标准曲线测定；c为内参基因GOS的灵敏度及标准曲线测定；d为边界序列(品系特异性)的灵敏度及标准曲线测定。a-d中，A-H均表示所检测的模板(标准分子PEASY-KF6)的用量，A为1.5X 1O7拷贝，B为1.5X IO6拷贝，C为1.5 X 1O5 拷贝，D 为 1.5 X 1O4 拷贝，E 为 1.5 X 1O3 拷贝，F 为 1.5 X 1O2 拷贝，G 为 1.5 X 1O1拷贝，H为1.5X10°拷贝。a-d中，标准曲线的横坐标均表示起始拷贝数的对数，纵坐标均表示Ct值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pEASY-T3载体:北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CT301。转基因水稻品系科丰6号(GM0+)(转CpTI基因水稻):中国检验检疫科学研究院；戎俊，宋志平，苏军，夏辉，王锋，卢宝荣.Bt/CpTI本文档来自技高网...
【技术保护点】
环状载体，包括豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段、苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段、水稻内源基因GOS片段，以及Ti质粒T?DNA的边界序列片段。
【技术特征摘要】
1.环状载体，包括豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段、苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段、水稻内源基因GOS片段，以及Ti质粒T-DNA的边界序列片段。2.根据权利要求1所述的环状载体，其特征在于:所述豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段的序列如序列表中序列I的第10-101位所示；或 所述苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段的序列如序列表中序列I的第265-336位所示；或 所述水稻内源基因GOS片段的序列如序列表中序列I的第191-258位所示；或 所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段的序列如序列表中序列I的第108-184位所示。3.根据权利要求1或2所述的环状载体，其特征在于:所述环状载体为将所述豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段、所述苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段、所述水稻内源基因GOS片段、所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段一同与PEASY-T3质粒相连后得到的重组载体。4.根据权利要求3所述的环状载体，其特征在于:所述环状载体为将如序列表中序列I所示的DNA片段...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄新，任鹤，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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