本发明专利技术公开了人EBLN-1基因的cDNA全长序列及其克隆方法。本发明专利技术通过5’RACE和3’RACE技术分别扩增了人EBLN-1基因cDNA的5’端片段和3’端片段并测序，再根据3’端序列、5’端序列及已知cDNA部分序列拼接出人EBLN-1基因的cDNA全长序列。并进行开放读码框和非翻译区分析，根据开放读码框推导得到编码EBLN-1蛋白的氨基酸序列。本发明专利技术提供的EBLN-1基因cDNA全长序列可以为后续通过表达重组蛋白用于制备相应抗体或进行结构生物学研究，通过RNA干扰和过表达研究EBLN-1基因功能，或进一步研究其非翻译区在该基因表达调控中的作用，并最终为阐明所述EBLN-1基因在人体中的生理作用及与疾病尤其是精神疾病的关系奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，更具体的是涉及一种从人少突胶质瘤细胞分离的人内源性博尔纳样核蛋白序列 I (endogenous Borna-1ike N element-1, EBLN-1)基因的 cDNA全长序列及其克隆方法。
技术介绍
博尔纳病病毒(Borna disease virus, BDV)是1885年在德国首先发现的一种非节段单股负链RNA病毒，具有严格的嗜神经性，其基因组编码6个病毒蛋白，核蛋白(N)为主要的感染标志物和致病蛋白。1996年德国科学家从抑郁症病人中成功分离出BDV，证明人体中亦存在BDV感染(Bode L, et al.Mol Psychiatry.1996)。近年来国内外的大量流行病学调查研究均提示人类精神疾病包括抑郁症的发生与BDV感染可能存在相关性，因此在2008年的国际博尔纳病病毒研究会议上BDV作为“情感病毒”这一概念被提出。2010 年 I 月，日本科学家 Masayuki Horie, Tomoyuki Honda 在《Nature》发表文章，报道在包括人类、非人灵长类、啮齿类和象类在内的多种哺乳动物基因组中发现与博尔纳病毒N基因(编码核蛋白)相类似的片段，命名为内源性博尔纳样核蛋白序列(endogenous Borna-1ike N Element, EBLN)。文章的作者推断这可能是远古时期,博尔纳病病毒感染宿主后，其基因整合进入宿主的基因组，并被遗传保留下来，成为宿主基因组中的病毒“化石”。(Horie，et al.Nature 2010)这是首个报道的存在于哺乳动物中的内源性非逆转录病毒片断，为人们理解内源性病毒序列的形成和博尔纳病病毒在宿主遗传进化中的作用提供了新的视角。存在于人类基因组中的EBLN有四个，分别命名为EBLN-1、EBLN-2、EBLN-3、EBLN-4，其中EBLN-1ID L0C340900)与BDV N核苷酸序列相似性最高，为58%，而EBLN-2因存在移码突变，开放读码框略短于EBLN-1。2010 年 7 月，Belyi 等(Belyi VA, et al.PLoS Pathog.2010)将非逆转录病毒家族中的单链RNA病毒的5666个基因与48种脊椎动物基因组进行了比对，发现在19种脊椎动物基因组内存在80个高保守性的内源性病毒DNA序列，而且所有这些序列都限于单分子负链RNA病毒目下的两个科:Bornaviruses and the Filoviruses。并且可能有如下机制:宿主对外源病毒致病性的抵御作用与EBLN的表达潜力有关联，例如BDV的易感宿主马、羊的基因组内不存在EBLN。提示EBLN对外源性病毒感染存在抵抗效应，体现出对宿主的保护作用，从而降低宿主对BDV的易感性。亦有研究报道一种黑冠鼠具有可遗传的天然对BDV的免疫力，此种特性与宿主内一种未知基因有关(Herzog S，Frese K, Rott R, etal.J Gen Virol.1991 )，很有可能这种未知基因就是啮齿类动物中的EBLN。从另一方面来说，EBLN-1为BDV整合入人类基因组的片断，与BDV N基因有同源性，序列相似度58%，可能具有潜在相似的生物学特征，如果激活或高表达亦可能对人体产生有害作用而导致抑郁症等精神疾病。因此，E BLN-1基因可能是抑郁症的一个潜在易感基因，其编码蛋白或参与抑郁症的病理生理过程，对其进行深入系统的研究，对于进一步明确抑郁症的分子遗传学基础和寻找药物治疗靶标有着重要意义。对于新基因的常用研究策略主要包括新基因的生物信息学及体内表达规律分析、功能获得与功能失活策略研究、基因编码产物相互作用蛋白的研究等方面，而这些都有赖于该基因结构模式的阐明，目前为止，EBLN-1基因的全长cDNA序列尚不清楚，严重滞后了对于EBLN-1的后续生理功能及病理作用研究。基于此，本专利技术应用利用5’ -RACE和3’ -RACE技术克隆人EBLN-1基因全长cDNA序列，并对其开放读码框和非翻译区结构以及编码氨基酸进行了初步分析预测，为深入开展EBLN-1基因后续研究提供了重要基础和客观依据。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种通过5’ -RACE和3’ -RACE技术克隆得到EBLN-1基因cDNA全长序列，还提供了所述EBLN-1基因cDNA的克隆方法。本专利技术采用的技术方案是:给出一种人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列为SEQID N0.1。该核苷酸序列对应的氨基酸序列为SEQ ID N0.7。上述人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列的克隆方法，包括如下步骤: (O从人少突胶质瘤细胞株中提取总RNA。(2)3’末端序列的扩增: 以步骤(I)中的总RNA为模板，使用3’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一条链； 以cDNA第一条链为模板，利用3’ -外引物、3’ -RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’ RACE外引物、3 ’ -内引物和3 ’ -RACE cDNA扩增试剂盒提供的3 ’ RACE内弓丨物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物I，所述3’ -外引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.2，3’-内引物的核苷酸序列为 SEQ ID N0.3 ； 将PCR扩增产物I克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列。(3)5’末端序列的扩增: 使用5’ -RACE cDNA扩增试剂盒对步骤(I)中的总RNA进行去磷酸化处理和“去帽子”反应，得到mRNA，所述mRNA的5’端连接5’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’RACE Adaptor引物，然后进行反转录反应，得到反转录产物； 以所述反转录产物为模板，利用5’-外引物、5’末端序列的扩增5’RACE外引物、5’-内弓I物和5 ’末端序列的扩增5 ’ RACE内弓丨物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物II，所述5，-外引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.4，5，-内引物核的苷酸序列为SEQ ID N0.5 ； 将PCR扩增产物II克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的5’末端序列。(4)根据所述人EBLN-1基因CDNA的3’末端序列和5’末端序列，以及公开的人EBLN-1基因cDNA的部分序列拼接得到人EBLN-1基因的cDNA全长序列。步骤(2)所述套式PCR扩增的扩增体系为: 3’第一轮PCR反应体系50 μ I包括如下成分:步骤(2)的反转录反应液2 μ ，IXcDNA稀释缓冲液II 8 μ 1,10 μΜ的3’-外引物2 μ 1,10 μ M的3’ RACE外引物2μ 1，10XLA PCR 缓冲液 II 4 μ 1,25 mM 的 MgCl2 3 μ 1,5 U/μ I 的 TaKaRa LA Taq 0.25μ I, dH20 28.75 μ I ;反应条件:94°C 3 分钟；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I 分钟，20个循环；72 °C 10分钟。3’第二轮PCR反应体系50 μ I包括如下成分:3’第一轮PCR产物I μ 1，dNTP 8μ 1，10XLA PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人EBLN?1基因cDNA全长核苷酸序列，其特征在于：该cDNA全长序列的核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1。
【技术特征摘要】
1.一种人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列，其特征在于:该cDNA全长序列的核苷酸序列为 SEQ ID N0.1。2.根据权利要求1所述人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列，其特征在于:所述核苷酸序列对应的氨基酸序列为SEQ ID N0.7。3.一种权利要求1所述的人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列的克隆方法，包括如下步骤: (1)从人少突胶质瘤细胞株中提取总RNA； (2)3’末端序列的扩增: 以步骤(I)中的总RNA为模板，使用3’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一条链； 以cDNA第一条链为模板，利用3’ -外引物、3’ -RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’ RACE外引物、3 ’ -内引物和3 ’ -RACE cDNA扩增试剂盒提供的3 ’ RACE内弓丨物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物I，所述3’-外引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.2，3’-内引物的核苷酸序列为 SEQ ID N0.3 ； 将PCR扩增产物I克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列； (3)5’末端序列的扩增: 使用5’ -RACE cDNA扩增试剂盒对步骤(I)中的总RNA进行去磷酸化处理和“去帽子”反应，得到mRNA，所述mRNA的5’端连接5’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’RACE Adaptor引物，然后进行反转录反应，得到反转录产物； 以所述反转录产物为模板，利用5’ -外引物、5’ -RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’ RACE外引物、5 ’ -内引物和5 ’ -RACE cDNA扩增试剂盒提供的5 ’ RACE内弓丨物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物II，所述5’-外引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.4，5’-内引物核的苷酸序列为 SEQ ID N0.5 ； 将PCR扩增产物II克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的5’末端序列； (4)根据所述人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列和5’末端序列，以及公开的人EBLN-1基因cDNA的部分序列拼接得到人EBLN-1基因的cDNA全长序列。4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:步骤(2)所述套式PCR扩增的扩增体系为: 3’第一轮PCR反应体系50 μ I包...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢鹏，张亮，杨德雨，雷阳，黄荣忠，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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