硝酸银提高青蒿丛生芽诱导、生长和再生的方法技术

一种硝酸银提高青蒿丛生芽诱导、生长及再生的方法。该方法涉及青蒿组织培养过程中丛生芽诱导、生长及丛生芽再生为青蒿植株的技术改进，属于生物技术领域。其特征在于在青蒿丛生芽诱导过程中，用硝酸银处理外植体，然后将外植体转移到丛生芽诱导培养基上进行诱导和培养，接下来将获得的丛生芽转移到MS培养基中进行再生。本发明专利技术显著地提高了青蒿丛生芽诱导率和每个外植体产生的丛生芽个数，而且对丛生芽的生长和再生具有明显的促进作用。该方法操作简单，成本低，可用于青蒿扩繁与种质培养和青蒿基因工程，应用前景广大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
的提高植物组织培养过程中丛生芽诱导、生长及再生的方法，具体是一种利用硝酸银处理提高青蒿丛生芽诱导的方法。
技术介绍
据世界卫生组织最新报告，疟疾是除艾滋病以外在世界范围内呈明显上升趋势的传染性疾病，世界上每年有3-5亿疟疾临床病例，其中大约三百万死亡。从传统的药用植物青蒿(Artemisia annua L.)植株中分离出的青蒿素是目前全球公认的治疗痕疾的首选药物，此外，还有研究表明，青蒿素对白血病、乳腺癌等一系列癌细胞有很好的抑制作用。青蒿植株中青蒿素含量很低(0.01-0.8% DW)，导致青蒿素类抗疟药物成本较高，限制了青蒿素的应用。利用基因工程技术提高青蒿植株 中青蒿素的含量，降低青蒿素的价格是满足青蒿素市场需求的重要手段之一，也是目前研究的重点。青蒿遗传转化是全世界公认的难题，虽然根癌农杆菌介导的青蒿遗传转化体系已有报道，但是青蒿的遗传转化很不稳定，而且效率很低，大大地影响了青蒿基因工程研究的进展。而较低的、不稳定的青蒿丛生芽诱导和分化效率是影响青蒿遗传转化的一个关键因素。硝酸银是最常用的植物组织培养添加剂，在培养基中添加硝酸银可以促进愈伤组织的器官发生、体细胞胚的形成以及离体植物的再生，诱导许多单双子叶植物的形态建成，促进芽原基的产生和伸长，甚至还可以增加外植体不定芽产生的数目。但是硝酸银对青蒿丛生芽诱导、分化的影响目前还不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有青蒿组培体系的不足，提供一种利用硝酸银处理提高青蒿丛生芽诱导、分化及再生的方法，该方法能简单、有效地提高青蒿丛生芽诱导、生长和再生，本专利技术可以用于青蒿的快速扩繁与种质保存，也可用于青蒿基因工程，以提高青蒿遗传转化效率，最终提高青蒿中青蒿素的含量。本专利技术是通过如下技术方案实现的，将青蒿种子种植于MS培养基中发苗、培养和扩繁。选取青蒿叶片作为外植体，将外植体置于含2mg/l硝酸银的丛生芽诱导培养基中培养20天，丛生芽诱导率和每个外植体的丛生芽数显著增加；然后将具有丛生芽的外植体转移到普通丛生芽诱导培养基中培养30天，经硝酸银处理的丛生芽高度明显增加；将丛生芽转移到普通MS培养基中进行生根和植株再生，经硝酸银处理的丛生芽的再生植株高度明显增加。所述MS培养基，通过在MS培养液中另外添加30g/l的蔗糖和6.0g/Ι的琼脂而得。其中MS培养液为Murashige and Skoog于1962年公布。所述的选取青蒿叶片作为外植体，是指取培养25天的青蒿组培苗，取中上部叶片作为外植体。所述普通丛生芽诱导培养基，是通过MS培养基中添加1.0mg/1 6-BA和0.05mg/lNAA而得。所述的硝酸银，是指硝酸银水溶液，过滤灭菌，4°C避光保存。所述的添加硝酸银的丛生芽诱导培养基，通过在灭菌后的培养基温度降至60°C以下时添加终浓度为2mg/l的硝酸银溶液而得。所述的丛生芽诱导是指丛生芽诱导率、每个外植体丛生芽个数；所谓的丛生芽再生是指丛生芽高度及再生青蒿植株的高度。丛生芽诱导率通过计算诱导出丛生芽的外植体占总外植体的百分比而得；丛生芽个数通过计算丛生芽的总数与诱导出丛生芽的外植体总数的比率而得；丛生芽高度指诱导出的丛生芽的平均高度；再生植株的高度指由丛生芽发育成的植株的高度。本专利技术的原理在于，青蒿组织培养过程中会产生大量的乙烯，过多的乙烯能阻止体细胞胚胎发生，抑制丛生芽诱导及分化。硝酸银可以通过干扰乙烯受体(ETRl)与乙烯的结合，从而抑制乙烯产生引起的生理反应。因此在青蒿组织培养过程中，在培养基中添加硝酸银可以促进丛生芽诱导及分化。本专利技术的有益效果是，在青蒿组培过程中通过在培养基中添加硝酸银这一操作简单、成本低廉的步骤，可以有效地提高丛生芽诱导率，增加每个外植体的丛生芽个数，而且能够促进丛生芽生长以及再生植株的生长，本专利技术可以应用于青蒿的快繁与种质保存，也可用于青蒿基因工程中的遗传转化系统以提高青蒿青蒿遗传转化效率。附图说明图1.硝酸银(AgNO3)对青蒿丛生芽诱导率、丛生芽个数、丛生芽高度及再生植株生长的影响 具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明:本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，下面给出详细的实施方式和具体的操作过程。实施例硝酸银溶液的配制:称取1.0g硝酸银，加水溶解，定容至100ml，过滤灭菌，4°C避光保存。青蒿无菌组培苗的获得:将001青蒿种子(来源于重庆酉阳)先用自来水冲洗，进行常规消毒具体操作包括在超净工作台上先用70%酒精浸泡30秒，再用0.1%的氯化汞消毒5分钟，然后在无菌水中震荡冲洗5次。将消毒后的种子置于MS培养基上萌发，待萌发的小苗长至3cm左右时，将小苗转移至MS培养基中进行组培苗培养。组培苗每30天扩繁一次。MS培养基配方为MS培养液中添加30g/l的蔗糖和6.0g/Ι的琼脂，MS培养液为Murashigeand Skoog 于 1962 年公布。青蒿丛生芽的诱导:配制丛生芽诱导培养基(配方为MS培养基+L Omg/16-BA+0.05mg/lNAA)，高压灭菌后待培养基温度降至60°C以下时，培养基加入硝酸银溶液混匀后倒入培养皿中。选取苗龄25天左右的001青蒿中上部叶片作为外植体，用剪刀剪下外植体并将外植体平铺在含硝酸银(2mg/l)的丛生芽诱导培养基平板上，在植物组培室培养20天后观察丛生芽诱导情况，统计丛生芽诱导率和每个外植体的丛生芽个数。用在普通丛生芽诱导培养基上培养的外植体作对照。结果发现硝酸银可以明显抑制愈伤组织的产生显著促进青蒿丛生芽诱导，丛生芽诱导率和每个外植体的丛生芽个数分别增加了 25%和110%。青蒿丛生芽的生长:为了利于丛生芽的生长，将丛生芽诱导培养基分装到50ml三角瓶中。将经过硝酸银处理后的外植体转移到普通丛生芽诱导培养基的三角瓶中继续培养30天后统计丛生芽的平均高度，与在普通丛生芽诱导培养基上诱导和培养的丛生芽高度作比较，结果发现硝酸银可以显著提高丛生芽的平均高度，与对照相比提高了 78%。青蒿丛生芽的再生:将高度一致的丛生芽转移到普通MS培养基的广口瓶中进行培养，结果发现培养5天后两组丛生芽都有不定根形成，培养20天后，统计两组再生青蒿植株的高度。结果发现硝酸银可以显著促进再生植株的生长，和对照相比提高了 33%。从结果看出，在青蒿组织培养过程中，在丛生芽诱导阶段用2mg/l硝酸银处理20天即可促进青蒿丛生芽诱导，丛生芽诱导率和每个外植体诱导出的丛生芽个数显著增加；硝酸银处理对丛生芽的生长也有显著的促进作用，丛生芽高度显著高于没有经过硝酸银处理的丛生芽；硝酸银处理 对丛生芽再生植株的生长也有促进，再生植株的株高显著增加。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硝酸银促进青蒿丛生芽诱导、生长和再生的方法，其特征在于，首先将青蒿种子种植于MS培养基中萌发、培养和扩繁，然后将取青蒿组培苗叶片作为外植体，用硝酸银处理后转移至丛生芽诱导培养基上继续培养，然后将丛生芽转移至MS培养基中生根、培养，硝酸银即能促进青蒿丛生芽诱导、生长和再生；?所述的青蒿种子是来源于重庆酉阳的001青蒿株系；?所述的MS培养基，是通过在MS培养液中另外添加30g/l蔗糖和6.0g/l琼脂而得，MS培养液为Murashige?and?Skoog于1962年公布；?所述的丛生芽诱导培养基，是通过在MS培养基中添加1.0mg/l?6?BA和0.05mg/l?NAA而得。

【技术特征摘要】
1.一种硝酸银促进青蒿丛生芽诱导、生长和再生的方法，其特征在于，首先将青蒿种子种植于MS培养基中萌发、培养和扩繁，然后将取青蒿组培苗叶片作为外植体，用硝酸银处理后转移至丛生芽诱导培养基上继续培养，然后将丛生芽转移至MS培养基中生根、培养，硝酸银即能促进青蒿丛生芽诱导、生长和再生； 所述的青蒿种子是来源于重庆酉阳的OOl青蒿株系； 所述的MS培养基，是通过在MS培养液中另外添加30g/l蔗糖和6.0g/Ι琼脂而得，MS培养液为Murashige and Skoog于1962年公布； 所述的丛生芽诱导培养基，是通过在MS培养基中添加1.0mg/1 6-BA和0.05mg/l NAA而得。2.根据权利要求1所述的硝酸银促进青蒿丛生芽诱导、生长和再生的方法，其特征是，所述的取青蒿组培苗叶片作为外植体，是指:无菌扩繁的青蒿植株培养至25天时，选择中上部叶片，用剪刀剪下作为丛生芽诱导的外植体。3.根据权利要求1所述的硝酸银促进青蒿丛生芽诱导、生长和再生的方法，其特征是，所述的硝酸银，是指硝酸银水溶液，过滤灭菌，4°C避光保存。4.根据权利要求1所述的硝酸银促进青蒿丛生芽诱导、生长和再生的方法，其特征是，所述的硝酸银处理，是指:丛生芽诱导培养基灭菌后降至60°C时添加2mg/l的硝酸银，混匀倒入平皿，将外植体平铺于添加硝酸银的丛生芽诱导培养基平板上，在植物组培室培养20天。5.根据权利要求1所述的硝酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷彩燕，叶和春，王红，王红卫，白润娥，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：