本发明专利技术公开了一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴幼儿乳粉中唾液酸的方法。本发明专利技术在原有高效液相色谱法检测乳粉中唾液酸的基础上，结合超高效液相色谱(UPLC)技术，对样品中三种形式唾液酸进行提取，从而建立了灵敏度更高、更快速的超高效液相色谱串联质谱检测婴幼儿配方乳中唾液酸的方法。采用本发明专利技术的方法唾液酸的平均回收率在84.3%～98.9%之间，相对标准偏差为4.9%～8.2%；唾液酸的最低检测限为0.01μg/mL。该方法简单而方便操作，采用了较好的分离方式，基质效应较小，前处理采用了水解后高速离心的过程，简便宜于操作，有效避免了复杂样品前处理过程中唾液酸的损失，提高了回收率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分析婴儿乳粉中唾液酸的方法，特别涉及，属于食品检测领域。
技术介绍
唾液酸，是指一系列含九个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的统称，其系统命名为5-氨基-3，5- 二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。它在人乳和婴儿配方乳中，分别以游离、低聚糖结合和蛋白结合形式存在，人乳低聚糖结合唾液酸约占73%，婴儿配方乳蛋白结合唾液酸约占70%,主要是N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac),所以常把N-乙酰神经氨酸称为唾液酸，牛乳和婴儿配方乳中唾液酸含量都很低。最新报道证明唾液酸也是一种天然的大脑营养素，能促进婴幼儿的记忆力和智力发育，以其在母乳中的高含量而受到广泛的关注，但在牛奶和婴儿配方乳粉中的含量却很低。这也预示着在婴幼儿配方乳粉中，特别是针对早产儿的婴幼儿配方乳粉中添加唾液酸可以有效地促进他们的神经系统和大脑的发育，同时进一步提高其在生长早期的智力发育水平。用于唾液酸分析的方法很多，酶反应、抗体、凝集素以及病毒已经用于确定总唾液酸含量或检测特定类型的唾液酸；苔黑酚、间苯二酚、定期/硫代巴比妥酸比色法，分光光度法多年来也已广泛应用于唾液酸的检测。这些方法的共同局限是他们无法区分唾液酸的类型并且要求样品净化。而比色法和色谱光度测量法等传统方法则是用离子交换柱纯化酸水解样品后的唾液酸，这种方法样品中唾液酸损失较大，影响检测的准确性。食品中唾液酸的检测方法，文献报道有高效液相色谱法(HPLC)，但其前处理繁琐，需要求对唾液酸进行衍生化后在测定，增加了实验的复杂性，并且灵敏度和准确度还不是很理想。由于唾液酸在国内食品中应用的比较少，且乳中自身存在的基质，如蛋白质，维生素，钙，钾，镁等矿物质会对分析结果造成影响，因此关于对其检测的相关技术还不是很成熟。因此，研究一种高效快速的检测婴幼儿配方乳粉中唾液酸含量的方法，针对较低含量样品做进一步的优化处理，在其配方乳粉中提高唾液酸的含量，使其更接近母乳，从而更好的促进婴幼儿大脑的健康发育，满足婴幼儿成长的生理营养需要成为一种迫切的需要。目前，国内市场已有婴儿配方乳添加唾液酸，使其更接近人乳成分。随着添加唾液酸食品的增加，食品质量监督部门与生产企业质量控制需要也不断增多，势必要求更加准确和快速的检测方法。随着色谱柱填料技术的发展，基于1.7μπι小颗粒技术的超高效液相色谱(UPLC)比传统的HPLC具有更高的分离能力，质谱联用能够进行分子量的精确测定。栗晖等利用液相色谱-质谱法(栗晖、金一宝、刘红霞、于治国等，分析测试学报，2008, 11(27): 193-194)对奶粉中唾液酸含量进行了测定，以氢氧化四丁基铵水溶液_甲醇为流动相进行梯度洗脱，三重四极杆质谱采用负离子模式，检出限为0.06mg/L，相对标准偏差小于10%。所应用的色谱及质谱条件如下:色谱柱:XBridgeC18 (3.5 μ m，2.1mmX 100mm)(Waters, Massachusetts, USA);流动相:4mmol/L氢氧化四丁基铵水溶液-甲醇梯度洗脱；流速:0.2mL/min;进样量10 μ L;三重四极杆质谱采用负离子模式，离子源温度为110° C，离子源电离电压为3kV，雾化气流速为SOOL/tT1，离子采集方式采用多反应监测模式(MRM)，采集离子308.1>87.1,保留时间为6.lmin。该方法利用液相色谱串联三重四级杆质谱的方法，采用多反应负离子监测模式，流动相选择氢氧化四丁基铵水溶液-甲醇溶液进行梯度洗脱，对奶粉中的唾液酸实现了良好的分离，保留时间为6.lmin，唾液酸的最低检出限为0.06mg/L，相对标准偏差小于10%。但在质谱分离，应用电喷雾离子源对母离子全扫描时，我们发现，负离子多反应监测模式下母离子的丰度值并不是很高，为此结合唾液酸的化学结构式我们大胆假设，完全可以应用正离子多 反应监测模式对唾液酸标准品的母离子进行全扫描，找到在负源和正源条件下丰度值更高的可靠质谱条件，为提高检测方法的灵敏度和准确度奠定基础；其次在结合色谱柱选择流动相时，我们认为流动相应该使唾液酸在色谱柱上得到很好的分离，在保留时间方面得到最佳的响应，因此在研究流动相梯度洗脱时要弃繁从简，优中选优确定流动相及其配比，进而提高本方法的灵敏度和检出限，为建立行业标准做基础。冯君等采用高效液相色谱法对乳中唾液酸的含量进行了测定(冯君，李宏基，韩立强，李卫华，李平，杨国宇，现代食品科技，2007，12:23)，利用酸水解法把乳中的唾液酸释放出来，以邻苯二氨盐酸盐(10mg/mL)为衍生化试剂，在80°C水浴锅中衍生40min,采用Symmetry C18柱(250mmX4.6mm, 5 μ m);流动相为1.0%的四氢呋喃水溶液(含0.2%磷酸)-乙腈(92:8);流速为1.0mL/min，柱温为35°C ;紫外检测波长230nm。结果表明，唾液酸在1(Γ320μ g/mL范围内线性良好,N-乙酰神经氨酸的最低检测限为0.25 μ g/mL,平均回收率为95.7%。该方法利用常规的高效液相色谱法，因为大多数的糖类化合物没有发色基团，唾液酸也不例外，所以HPLC的分析需要对唾液酸进行衍生后分离测定，增加了实验的复杂性和可能的干扰因素。衍生化试剂从经济角度考虑相对昂贵，衍生化过程相对比较麻烦，繁琐；同时高效液相色谱检测的灵敏度和准确度有限，故研究方法应想办法预防前处理的繁琐，降低实验的复杂性和可能的干扰因素，进一步确定最优化最简单的前处理条件，采用合理的分离和检测技术，进而完善婴幼儿乳粉中唾液酸的检测技术和标准。该方法虽然可准确测定乳中唾液酸含量，但灵敏度和准确性还有待进一步提高。
技术实现思路
针对目前现有技术中存在的问题，本专利技术在原有高效液相色谱法检测乳粉中唾液酸的基础上，基于1.7 μ m小颗粒的超高效液相色谱(UPLC)技术，对样品中三种形式唾液酸进行提取，从而建立了灵敏度更高、更快速的超高效液相色谱串联质谱检测婴幼儿配方乳中唾液酸的方法，实际检测样品效果明显。为了达到以上目的，本专利技术采用的技术手段为:本专利技术的一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴幼儿乳粉中唾液酸的方法，其特征在于包括以下步骤:(I)绘制标准曲线；(2)样品的前处理:对样品中三种形式唾液酸进行提取，所述的三种形式唾液酸分别为游离唾液酸、低聚糖结合唾液酸以及蛋白结合唾液酸；提取得到的三种形式唾液酸溶液分别采用HLB聚合物填料的固相萃取柱净化，采用超纯水作为淋洗液,氨水-甲醇混合溶液作为洗脱液；(3)将步骤(2)得到的净化后的提取物溶液混合后，调节pH值至2.5 3，用乙腈定容，0.22 um有机滤膜过滤，用UPLC-ES1-MS/MS进行测定；(4)质谱分析条件的选择及参数:离子源:电喷雾离子源；扫描方式:正离子扫描；检测方式:多反应监测系统；毛细管电压:3.0KV ;锥孔电压:45V ;源温度:150°C ;脱溶剂温度:450°C ;脱溶剂气流量:650L/hr ;锥孔反吹气流量:50L/hr ;碰撞气流量:0.24mL/min ;光电倍增器电压:650V ；(5)色谱分离条件:色谱柱及梯度洗脱:规格为50mmX2.lmm, 1.7 μ m 的 Waters ACQ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴幼儿乳粉中唾液酸的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）绘制标准曲线；（2）样品的前处理：对样品中三种形式唾液酸进行提取，所述的三种形式唾液酸分别为游离唾液酸、低聚糖结合唾液酸以及蛋白结合唾液酸；提取得到的三种形式唾液酸溶液分别采用HLB聚合物填料的固相萃取柱净化，采用超纯水作为淋洗液，氨水?甲醇混合溶液作为洗脱液；（3）将步骤（2）得到的净化后的提取物溶液混合后，调节pH值至2.5~3，用乙腈定容，0.22μm有机滤膜过滤，用UPLC?ESI?MS/MS进行测定；（4）质谱分析条件的选择及参数：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测系统；毛细管电压：3.0KV；锥孔电压：45V；源温度：150℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：650L/hr；锥孔反吹气流量：50L/hr；碰撞气流量：0.24mL/min；光电倍增器电压：650V；（5）色谱分离条件：色谱柱及梯度洗脱：规格为50mm×2.1mm,1.7μm的Waters?ACQUITY?Ultra?BEH?HILIC超高效液相色谱柱；柱温：30℃；样品室温度：30℃；进样量：5μL；流速：0.25mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸（v/v）水溶液。...
【技术特征摘要】
1.一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴幼儿乳粉中唾液酸的方法，其特征在于包括以下步骤: (O绘制标准曲线； (2)样品的前处理:对样品中三种形式唾液酸进行提取，所述的三种形式唾液酸分别为游离唾液酸、低聚糖结合唾液酸以及蛋白结合唾液酸； 提取得到的三种形式唾液酸溶液分别采用HLB聚合物填料的固相萃取柱净化，采用超纯水作为淋洗液，氨水-甲醇混合溶液作为洗脱液； (3)将步骤(2)得到的净化后的提取物溶液混合后，调节pH值至2.5 3，用乙腈定容，0.22 μ m有机滤膜过滤，用UPLC-ES1-MS/MS进行测定； (4)质谱分析条件的选择及参数: 离子源:电喷雾离子源；扫描方式:正离子扫描；检测方式:多反应监测系统；毛细管电压:3.0KV ;锥孔电压:45V ;源温度:150°C ;脱溶剂温度:450°C ;脱溶剂气流量:650L/hr ；锥孔反吹气流量:50L/hr ;碰撞气流量:0.24mL/min ;光电倍增器电压:650V ； (5)色谱分离条件: 色谱柱及梯度洗脱:规格为 50mmX2.1mm, 1.7μπι 的 Waters ACQUITY Ultra BEH HILIC超高效液相色谱柱；柱温:30°C ;样品室温度:30°C ;进样量:5μ L ;流速:0.25mL/min ;流动相A:乙腈；流动相B:0.1%甲酸(v/v)水溶液。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的三种形式唾液酸是按照以下方法提取: 游离和低聚糖结合唾液...
【专利技术属性】
技术研发人员：李春，刘宁，刘丽波，解鸿蕾，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。