本发明专利技术一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒及检测方法，其中该方法包括：植物病毒总RNA的提取，RT-LAMP反应和电泳检测或荧光染料检测，确定植物是否带病。本发明专利技术根据CGMMV的外壳蛋白基因保守区域设计了RT-LAMP引物，采用RT-LAMP技术建立了一种快速、灵敏、高度特异性的检测黄瓜、西瓜和葫芦等葫芦科植物植株上CGMMV的检测技术及其在病害诊断上的应用方法。本发明专利技术可以利用快速抽提RNA和常规RNA抽提作为RNA模板用于RT-LAMP实验。利用这一方法可以快速鉴定出黄瓜绿斑驳花叶病毒植株样本，进而采取针对性的检疫性保护措施，减少病害带来的损失。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业科学
，涉及西瓜、黄瓜和葫芦等葫芦科植物上黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测技术及其在病害诊断上的应用，具体涉及一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus, CGMMV)属番爺丛矮病毒科(Tombusviridae)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员。该病严重为害葫芦科作物，为我国的检疫性有害生物。黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期染病幼苗顶尖部的2 3片叶子现亮绿或暗绿色斑驳，叶片较平，产生暗绿色斑驳的病部隆起，新叶浓绿，后期叶脉透化，叶片变小，引起植株矮化，叶片斑驳扭曲，呈系统性传染。瓜条染病现浓绿色花斑，有的也产生瘤状物，致果实成为畸形瓜，影响商品价值，严重的减产25%左右。自然界主要侵染甜瓜、西瓜、黄瓜、南瓜及瓠瓜等多种葫芦科作物，通过种子和土壤传播，此外也可通过汁液，农事操作及叶片接触等方式进行传播。带毒种子传播是该病毒远距离传播的主要途径。该病自1935年被发现以来，曾先后在英国、德国、丹麦、荷兰、俄罗斯、印度、日本、韩国以及我国台湾发生并造成严重危害。黄瓜绿斑驳病毒病以前在我国大陆没有发生记载，2006年国内个别地方发现西瓜绿斑驳病毒病，2006年12月份中国农业部发布788号公告，将其列为全国植物检疫性有害生物。目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有:生物学实验，血清学检测，电镜观察及分子生物学检测。由于传统的植物病毒监测方法，如电镜观察、传统的生物学接种鉴定等这些方法很难分别出是否是黄瓜绿斑驳花叶病毒，因此需要一个快速准确的方法来检测该病毒。环介导恒温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),是由Notomi等在2000年专利技术 的一种新颖的恒温核酸扩增方法，他是一种高灵敏度的链置换技术，一种新型的PCR替代技术。LAMP特点是针对靶基因的6个区域设计了 4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶一Bst DNA polymerase在恒温的条件下反应60min就可以完成核酸扩增反应，通过荧光染色后在紫外光下观察可以清晰的观察到反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要昂贵的PCR仪，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病监测和快速诊断。但是，目前尚没有将RT-LAMP技术应用在黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的检测上。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的RT-LAMP引物组。本专利技术的另一目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒。本专利技术又一目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法。该方法用于快速检测西瓜、黄瓜和葫芦等葫芦科上黄瓜绿斑驳花叶病毒，通过该方法可以快速诊断出疑似病株是否携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现:一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的RT-LAMP引物组，其在于所述的RT-LAMP引物组包含一对外引物和一对内引物，所述外引物对F3、B3的序列分别为SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示，所述内引物对FIP、BIP的序列分别为SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示。上述的引物组在制备黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测试剂盒或检测试剂中的应用。一种含有上述的引物组的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒。上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒，其在于所述的试剂盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反应液、DEPC水和荧光染料SYBR Green I检测液组成的检测体系。上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒，其在于所述植物病毒RNA快速提取液包含0.5M NaOH和Tris-HCL (pH8.0);采用植物病毒RNA快速提取液提取样品粗提总RNA，将提取的样品粗提总RNA加入到RT-LAMP反应液中混合，建立扩增体系；以反应总体积IOyL为例，所述扩增体系中各组分的含量为:样品粗提总RNA0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 Bst DNAPolymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ, 0.2 μ M 的 F3 和 0.2 μ M的B3，补充DEPC水至10 μ L0`一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其在于使用上述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待检测样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，具体包括以下步骤:(I)提取样品粗提总RNA ；(2)取步骤(I)提取的样品粗提总RNA加入到RT-LAMP反应液中混合，建立扩增体系;(3)在63 64°C恒温水浴中反应6(T75min ；(4)结果诊断:取荧光染料检测液SYBR Green I加入到步骤(3)扩增反应产物中进行诊断，在紫外光下观察，呈阳性即显绿色的表示样本中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒，呈阴性即保持染料橙色的表示样本不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。步骤(I)所述样本粗提总RNA的提取方法为:用刚采集的病叶在0.5M NaOH溶液中快速研磨制成研磨液，将研磨液加入到Tris-HCL (pH8.0)中制成样品粗提总RNA提取液。 所述的病叶和0.5M NaOH溶液的质量体积比g:mL为1:4 ;所述混合液和Tris-HCL(pH8.0)的体积比为I:49o步骤(2)中所述反应总体积IOyL为例，扩增体系中各组分的含量为:样品粗提总 RNA 0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 BstDNA Polymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ，0.2 μ M 的 F3 和0.2 μ M 的 B3,补充 DEPC 水至 10 μ L。本专利技术所提供的快速检测病株上黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，具体包括以下详细步骤:I)根据NCBI已报道的黄瓜绿斑驳花叶病毒核苷酸序列，通过软件DNAstar分析后找出该病核酸外壳蛋白基因保守区域序列作为模板参考序列使用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计弓I物；2)快速提取法提取植株样品粗提总RNA ；3)设置不同Mg2+浓度、dNTP浓度、内外引物浓度比例、Betaine浓度、确定最佳反应体系；分别改变反应时间和温度进行RT-LAMP扩增反应，确定最佳反应条件。4)通过紫外光或肉眼判断SYBR Green I染色对RT-LAMP产物进行可视化处理。5)在最佳反应参数条件下，与RT-PCR方法进行比较，验证RT-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的RT?LAMP引物组，其特征在于所述的RT?LAMP引物组包含一对外引物和一对内引物，所述外引物对F3、B3的序列分别为SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示，所述内引物对FIP、BIP的序列分别为SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陶小荣，李靖玉，卫其巍，张雯娜，吴鉴艳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。