一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，本发明专利技术综合考虑了影响VIGS沉默效率的多方面因素，通过不同接种方法与接种农杆菌菌液浓度，结合沉默效率：沉默频率、沉默效力、沉默效果，评价方法得到了醋栗番茄病毒诱导基因沉默的最优体系，适宜的接种方法与浓度提高了沉默效率。用本发明专利技术方法评价VIGS沉默效率时间短、速度快、效率高，可应用于其他植物病毒诱导基因沉默优化体系的评价，为快速验证基因功能提供了有效的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及。
技术介绍
病毒诱导的基因沉默与传统的研究植物基因功能的方法相比，具有简便高效、周期性短、不需要对植物进行转化和可以沉默基因家族等特点，并且可以在物种间和物种内不同遗传背景的植物间进行基因功能的比较。自1995年Kumagai等首次利用重组烟草花叶病毒(tobaccomosaic virus,TMV)在本氏烟中成功沉默了植物内源八氢番爺红素脱氢酶基因以来，多种VIGS载体相继得到开发和应用。TRV是目前应用最广的VIGS载体.它是由TRVl与TRV2两条RNA病毒链组成，TRVl用于辅助载有靶基因片段的TRV2在植物体内移动。TRV病毒载体有病毒症状较轻、沉默效率高且持久、各种组织均可产生沉默等优点，因而已被广泛应用。尽管VIGS技术具有很多优越性，但还有其内在固有的局限性:VIGS很少能够完全沉默或抑制靶基因的表达，而且沉默水平因不同的植物种类和实验方法而不同，因此，应结合植物种类使用正确的方法获得最大沉默效率。影响VIGS沉默效率有多种因子:1.VIGS载体中插入的目的片段，在VIGS载体中插入的目的片段序列和大小均影响VIGS沉默效率。一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)重组病毒质粒TRV2?PDS的构建与转化农杆菌；(2)醋栗番茄幼苗培养；(3)接种农杆菌浸染液于醋栗番茄幼苗；(4)病毒诱导醋栗番茄PDS基因沉默。

【技术特征摘要】
1.一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)重组病毒质粒TRV2-PDS的构建与转化农杆菌； (2)醋栗番茄幼苗培养； (3)接种农杆菌浸染液于醋栗番茄幼苗； (4)病毒诱导醋栗番茄PDS基因沉默。2.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(I)中，获得所述重组病毒质粒TRV2-PDS为pTRV2载体与408bp PDS基因片段通过Sac I和Xho I酶切位点连接，连接产物转化DH5 α大肠杆菌，于含有卡那霉素的LB平板上37°C静置培养12-16h，获得单克隆菌落，单克隆菌落在含卡那霉素的LB液体培养基中37°C、200rpm/min震荡培养12_16h，扩繁得到的单克隆菌液通过裂解法提取重组质粒，重组质粒经过Sac I和Xho I双酶切验证，获得TRV2-PDS重组质粒。3.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(I)中，TRV2-PDS重组质粒转化农杆菌的方法为冻融法，转化的农杆菌菌株为GV3101，在含有卡那霉素、庆大霉素、利福平抗生素的LB平板上28 °C静置培养36_48h，筛选出含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆菌落。4.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的番茄幼苗特征为，播种后12-14d...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁燕，李翠，张振才，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：