本发明专利技术公开了一种云南红梨色素合成调控和毛状体发生发育调控蛋白PyMYB基因及其原核表达载体，及原核表达载体的应用；本发明专利技术利用RT-PCR技术从云红梨1号红色果皮中克隆PyMYB基因，然后再利用原核表达载体将该基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达，采用GST凝胶柱纯化法纯化，获得云南红梨PyMYB纯化蛋白，云南红梨PyMYB纯化蛋白用于制备PyMYB特异性抗体和其在PyMYB蛋白表达检测中及免疫沉淀、染色质免疫共沉淀和融合蛋白沉降实验中的应用；本发明专利技术中所制备的抗体特异性强，能够准确的检测PyMYB蛋白的亚细胞定位、用于免疫共沉淀实验中验证蛋白互作、高效分离PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨色素和毛状体发生发育调控蛋白基因PyMYB及其原核表达载体，和原核表达载体和PyMYB抗体的应用。
技术介绍
红色表皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨I号四个栽培品种。但生产中除云红梨I号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究表明，在拟南芥中，MYB转录因子PAP1/MYB75通过调控拟南芥花青素生物合成途径中的关键酶调控花青素的合成；拟南芥tt (TRANSPARENT TESTA)突变体中，类黄酮生物合成途径的许多步骤都是由MYB_bHLH复合物调控的，该复合物主要催化黄酮醇合成级联反应中的查尔酮合酶(CK )、查尔酮异构酶W/)、二氢黄酮醇还原酶(/ )和黄酮醇合酶0 )基因都是在光应答下协同表达的；油菜中过表达拟南芥MYB转录因子PAPl，导致叶片中酚类化合物大幅度的上升；ESpley等人将苹果中MdMYBlO转录因子在苹果中过表达，获得了红色的转基因苹果；Feng等将“奥冠”梨中的PyMYBlO在拟南芥中过表达，结果增强了拟南芥成熟种子中花青素的含量。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和MYB蛋白(GL1，PAPU PAP2、CPC、TRY)组合，形成MYB/bHLH/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等人通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Zhao等人通过离子轰击试验证明了 TTGl，bHLH转录因子GL3，MYB转录因子GLl和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB, CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。Gonzalez等人发现MYB5和TT2 (MYB)与TTGl能够形成复合物控制外种皮的分化。目前，对云南红梨着色机理研究表明，云南红梨果皮花青素的生物合成可能是由MYB/bHLH/WD40调控的。但是还没有专门用于准确检测PyMYB蛋白的亚细胞定位、高效的进行PyMYB蛋白的纯化、高效分离PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况及研究蛋白互作的抗体。本专利技术选择着色最好且稳定的‘云红梨I号’作为试验材料，开展云南红梨‘云红梨I号’ PyMYB转录因子基因的克隆、序列分析和原核表达、蛋白纯化抗体制备的工作，将弥补这方面的空白，也将为研究云南红梨果皮MYB转录因子在果皮着色机理及果实育种中提供工具。云南红梨属于稀有资源，世界市场缺口较大；此外，云南红梨外观和内在品质好，商品价值高，深受广大消费者青睐。因此，红梨将成为梨产业发展的主要方向，红梨育种成为梨树育种的重要目标。但是，指导育种的红梨着色的科学理论匮乏，本专利技术的成果将为果树及花卉的分子育种奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种云南红梨基因，该基因来源于云南红梨，该基因是云南红梨花青素和毛状体发生发育调控因子，基因在R2结构域中具有所有花青素调控蛋白中的R残基，其R3结构域中具有碱性螺旋环螺旋(bHLH)结合结构域，其C末端也具有 Motif 6。本专利技术另一目的是提供云南红梨基因的原核表达载体pGEX-4T_/y#7凡该载体含有招基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，/>#73基因的N端含有GST标签。本专利技术另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨色素合成特异性调控蛋白PyMYB中，PyMYB蛋白其具有典型的R2R3MYB结构域。本专利技术另一目的是将原核表达载体应用在制备PyMYB特异性抗体中，PyMYB特异性抗体应用在PyMYB蛋白的亚细胞定位检测、PyMYB蛋白的纯化、PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段的高效分离、检测其在转基因植物中的表达情况并且用于免疫共沉淀(Co-1P)、染色质免疫共沉淀(ChIP)、融合蛋白沉降(pull-down)实验中。本专利技术的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的: 1、原核表达载体的构建 (1)根据NCBI数据库中梨的基因(AccessionNumber:EU153575.1)序列和原核表达载体pGEX-4T-l多克隆酶切位点，设计一对特异性引物PyMYB-F =Sy-GGATCCGTCTACATGGAGGGATATAACGTTAACTTG-3’ 和 PyMYB-R 5’ -GTCGACGATATCTTCTTCTTTTGAATGATTCCAAAGG-3，,在上下游引物的5’端分别加入和fe7I酶切位点(下划线为酶切位点)。以云红梨I号总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PyMYB-Y和PyMYBi进行扩增，得到特异性片段； (2)回收/>#7沒的cDNA全长片段； ⑶PyMYB基因的T/A克隆和测序:使用pMD18T载体，将回收的cDNA片段进行T/A克隆，酶切验证后，进行测序分析； (A)PyMYB基因测序和生物信息学分析，并上传GenBank数据库； (5)构建原核表达载体:使用Banm和Sall对质粒pMD_18T-/y#7S和载体pGEX_4T_l进行双酶切，分别回收、连接，获得原核表达载体pGEX-4T-/y#7S。2,PyMYB基因的原核表达 使用热刺激法将pGEX-4T-/y#7S转入大肠杆菌力中，在IPTG诱导下筛选最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达。3、PyMYB蛋白的纯化 收集菌体，进行超声破碎，过GST琼脂糖亲和层析柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。4、使用PyMYB纯化蛋白制备抗体，使用PyMYB抗体可以检测PyMYB蛋白。实验结果显示本专利技术的重组载体pGEX-4T_/y#7S含有谷胱甘肽S转移酶(GST)标签，可以表达获得纯化含有GST标签的蛋白，制备的抗体可用于GST pull-down实验中研究与PyMYB蛋白相互作用的蛋白，获得GST融合蛋白也可以通过Western Blot用商业化的GST单克隆抗体检测PyMYB蛋白，本专利技术制备的PyMYB抗体，可以弥补目前没有专门检测PyMYB蛋白、PyMYB蛋白的亚细胞定位以及用于免疫共沉淀(Co-1P)和融合蛋白沉降技术(pull-down)研究蛋白互作的抗体。本专利技术中所制备的抗体特异性强，能够准确的检测PyMYB蛋白的亚细胞定位、用于免疫共沉淀实验(Co-1P)中验证蛋白互作、高效分离PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况。附图说明图1为本专利技术中提取的云红梨I号的总RNA电泳示意 图2为本专利技术基因扩增后的扩增产物电泳示意 图3为本专利技术pMD18T-/y#l^的酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
云南红梨PyMYB基因，其特征在于：PyMYB基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示或编码如SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.云南红梨基因，其特征在于沒基因的核苷酸序列如SEQID N0:3所示或编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白质。2.权利要求1所述云南红梨/>#7沒基因的原核表达载体pGEX-4T-/y#7凡其特征在于:该载体含有招基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，P...
【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，崔道雷，张晓东，樊磊，陈丽梅，舒群，苏俊，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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