本发明专利技术公开了一种重组蛋白PACAP38-NtA及其编码基因与应用。该重组蛋白PACAP38-NtA的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。编码该重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。将如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列克隆至原核表达载体pET-3c中，转染到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株。本发明专利技术使用小型生物反应器发酵该菌株，使用常用的离子交换层析和镍柱亲和层析两步纯化法，操作简单，能获得高纯度的目的蛋白。获得的重组PACAP38-NtA融合蛋白能与层粘连蛋白特异性结合，能有效的促进神经元样细胞PC12进行增殖和分化，作用于小鼠角膜刮伤部位，能提高损伤部位的修复能力，可用于制备角膜损伤修复的药品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组蛋白，特别涉及一种重组蛋白PACAP38-NtA及其编码基因与应用。
技术介绍
垂体腺苷酸环化酶激活多妝(PituitaryAdenylate Cyclase-activatingPolypeptide, PACAP)是Miyata等于1989年在研究下丘脑促垂体激素时发现的一种具有广泛生物学活性的多肽，是促胰液素/高血糖素/血管活性肠肽(vasoaetive intestinalpeptide, VlP)家族中的新成员。PACAP在体内存在两种形式，分别为含38个氨基酸的PACAP38和缺失羧基端11个氨基酸的截短肽PACAP27。PACAP38比PACAP27在组织中的含量更丰富，活性更高。PACAP及其受体不仅分布在中枢神经系统和周围神经系统，而且在周围组织和器官也广泛分布，如胰腺、胰岛、消化道、生殖腺等。PACAP主要有3种受体:PACIR、VPACIR和VPAC2R。PACIR是PACAP的特异性受体，受体VPACIR和VPAC2R是PACAP和VIP共同的受体。受体PACIR比VPACIR和VPAC2R在中枢神经系统的含量及分布多，3种受体在外周各脏器组织中均分布广泛。鉴于其分布及生物学特性，大量实验表明PAClR在介导神经系统的发育和保护方面起重要作用。在眼部，PACAP及其受体主要分布在角膜、虹膜、睫状神经节、脉络膜和视网膜等处。PACAP及其特异 受体PACI在眼部分布广泛，PACAP不仅有营养及修复神经作用，还促角膜上皮修复及参与调解眼表炎症反应。因此对角膜瓣术后神经修复及角膜感觉功能恢复有重要促进作用，而仅用PACAP38作用于角膜及角膜神经，虽也具有一定的修复作用，但其使用量较大，修复时间较长。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种重组蛋白PACAP38-NtA。本专利技术的另一目的在于提供编码所述的重组蛋白PACAP38_NtA的基因。本专利技术的再一目的在于提供表达所述的重组蛋白PACAP38_NtA的菌株及其发酵方法以及所述的重组蛋白PACAP38-NtA的纯化方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种重组蛋白PACAP38_NtA，其氨基酸序列如下所示:HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRIKNKGSGGGSGGGGSGGGGSNCPERELQEEEEEANWLTGTVEEMNDVPVHHTYSCKVRVWRYLKGKDIVTHEILLDGGNKVVIGGF ⑶ PLICDNQVSIODTRIFFVNPAPQYMWPAHRNELMLNSSLMRITLRNLEEVEHCVEEHRKLLADKPNSYFTQTPPTP ；编码所述的重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列如下所示: CACTCTGACGGTATCTTCACCGACTCTTACTCTCGTTACCGTAAACAGATGGCTGTTAAAAAATACCTGGCTGCTGTTCTGGGTAAACGTTACAAACAGCGTATCAAAAACAAAGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAACTGCCCGGAACGTGAACTGCAGGAAGAAGAAGAAGAAGCTAACGTTGTTCTGACCGGTACCGTTGAAGAAATCATGAACGACGTTCCGGTTCACCACACCTACTCTTGCAAAGTTCGTGTTTGGCGTTACCTGAAAGGTAAAGACATCGTTACCCACGAAATCCTGCTGGACGGTGGTAACAAAGTTGTTATCGGTGGTTTCGGTGACCCGCTGATCTGCGACAACCAGGTTTCTACCGGTGACACCCGTATCTTCTTCGTTAACCCGGCTCCGCAGTACATGTGGCCGGCTCACCGTAACGAACTGATGCTGAACTCTTCTCTGATGCGTATCACCCTGCGTAACCTGGAAGAAGTTGAACACTGCGTTGAAGAACACCGTAAACTGCTGGCTGACAAACCGAACTCTTACTTCACCCAGACCCCGCCGACCCCG ；所述的重组蛋白PACAP38-NtA的制备方法，包括将编码重组蛋白PACAP38_NtA的核苷酸序列重组到表达载体上，将表达载体转入宿主细胞中，得到表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株；接着将表达重组蛋白PACAP38_NtA的菌株发酵，发酵得到的菌体破碎，纯化，得到重组蛋白PACAP38-NtA。一种表达重组蛋白PACAP38_NtA的菌株，是将上述核苷酸序列转染到大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)得到;所述的表达重组蛋白PACAP38_NtA的菌株，更优选通过如下制备方法得到:(I)重组原核表达载体pET-3c/PACAP38_NtA的构建①设计PACAP38_NtA的基因序列，基因合成，得到了编码重组蛋白PACAP38_NtA的基因;②使用引物Fl和引物Rl对步骤①得到的编码重组蛋白PACAP38_NtA的基因进行PCR扩增，得到Xba 1-PACAP38-NtA-BamH I基因，该基因具有起始密码子ATG和两个终止密码子TAA、TGA,以及C末端含有6个His标签位点(引物Rl被方框包围住的部分)；引物Fl:5，-ATGCTCTAGAATGCACTCTGACGGTATCTTC-3，；引物Rl:5，-ATCGGGATCCTCATTA |ATGATGATGATGATGATC|CGGGGTCGGCGGGGT-3，；③将步骤②中获得的PCR产物与pMD1 18-T连接，得到重组克隆载体pMD 18-T/PACAP38-NtA ； ④用Xba I和BamHI双酶切步骤③得到的pMD 18-T/PACAP38_NtA，得到具有突出粘性末端的PACAP38-NtA片段；用Xba I和BamH I双酶切载体pET_3c，得到具有突出粘性末端的线性载体pET-3c ;将具有突出粘性末端的PACAP38-NtA片段和具有突出粘性末端的线性载体pET-3c连接，得到重组载体pET-3c/PACAP38-NtA ；(2)重组菌株的获得:将重组载体pET-3c/PACAP38_NtA转染到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)，得到表达重组蛋白PACAP38_NtA的重组菌株；步骤(I)①中所述的基因合成为通过基因合成公司进行合成；步骤(I)②中所述的PCR扩增的条件优选为:95°C 5分钟；95°C 30秒、63°C 30秒、72°C 40秒，30个循环；72°C延伸10分钟；所述的表达重组蛋白PACAP38_NtA的菌株 的发酵方法，包含如下步骤:I)活化:将表达重组蛋白PACAP38_NtA的重组菌株进行活化；活化的培养基为含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基；活化的条件为37°C，180rpm振荡培养8 IOh ;2)种子液的制备:将活化后的表达重组蛋白PACAP38_NtA的重组菌株逐级放大至发酵罐培养所需的种子液；逐级放大的培养基为含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基；每本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组蛋白PACAP38?NtA，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白PACAP38-NtA，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.编码权利要求1所述的重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。3.—种表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于:是将权利要求2所述的核苷酸序列转染到大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)得到。4.根据权利要求3所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于通过如下制备方法得到: Cl)重组原核表达载体pET-3c/PACAP38-NtA的构建 ①设计PACAP38-NtA的基因序列，基因合成，得到了编码重组蛋白PACAP38_NtA的基因； ②使用引物Fl和引物Rl对步骤①得到的编码重组蛋白PACAP38-NtA的基因进行PCR扩增，得到Xba 1-PACAP38-NtA-BamH I基因，该基因具有起始密码子ATG和两个终止密码子TAA、TGA，以及C末端含有6个His标签位点；引物 Fl:5，-ATGCTCTAGAATGCACTCTGACGGTATCTTC-3，；引物 Rl:5’ -ATCGGGATCCTCATTAATGATGATGATGATGATGCGGGGTCGGCGGGGT-3’ ； ③将步骤②中获得的PCR产物与pMD 18-T连接，得到重组克隆载体pMD 18-T/PACAP38-NtA ； ④用XbaI和BamHI双酶切步骤③得到的pMD 18_T/PACAP38_NtA，得到具有突出粘性末端的PACAP38-NtA片段；用Xba I和BamH I双酶切载体pET_3c，得到具有突出粘性末端的线性载体pET-3c ;将具有突出粘性末端的PACAP38-NtA片段和具有突出粘性末端的线性载体pET-3c连 接，得到重组载体pET-3c/PACAP38-NtA ； (2)重组菌株的获得:将重组载体pET-3c/PACAP38-NtA转染到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)，得到表达重组蛋白PACAP38_NtA的重组菌株。5.根据权利要求4所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于:步骤(I)②中所述的PCR扩增的条件为:95°C 5分钟；95°C 30秒、63°C 30秒、72°C 40秒，30个循环；72°C延伸10分钟。6.权利要求3 5任一项所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株的发酵方法，其特征在于包含如下步骤: O活化:将表达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株进行活化；活化的培养基为含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基；活化的条件为37°C，180rpm振荡培养8 IOh ; 2)种子液的制备:将活化后的表达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株逐级放大至发酵罐培养所需的种子液；逐级放大的培养基为含氨节西林和氯霉素的LB液体培养基；每一级培养的条件为37°C、180 200rpm培养IOh 12h ； 3)发酵罐发酵:将...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪岸，吴陆生，陈小佳，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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