本发明专利技术公开了一种具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架及其制备方法，从仿生角度出发，为了更好的模拟天然骨组织中细胞外基质的组分、结构与功能，选用壳聚糖、胶原、透明质酸和羟基磷灰石组分的组合，利用冷冻干燥相分离技术结合原位复合方法制备类似天然骨细胞外基质的人工骨缺损修复支架。本发明专利技术制备程序简单，工艺条件温和，制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/胶原/透明质酸骨缺损修复支架在组成与结构上与天然骨基质类似，性能优越，具有可塑性，可被加工成所需要的形状。
【技术实现步骤摘要】
一种具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架
本专利技术属于骨组织修复支架材料制造领域，具体涉及一种具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架及其制备方法。
技术介绍
生物医学材料的研究与开发对国民经济和社会的发展具有十分重要的意义。近几十年来，生物医学材料的研究与开发取得了很大进展，使成千上万的患者获得了康复，大大提高了人类的生命质量。硬组织材料是生物医学材料的重要组成部分，人体硬组织生物活性替代材料应具有行使替代部位的生理功能，如支撑作用或骨引导作用、能模拟人体骨的生长与吸收、参与植入部位的新陈代谢、与组织进行物质交换等。具有高度生物活性的人体硬组织替代材料一直是国内外学者研究的热点。按照仿生学的原理，越是与机体相似的材料越是能够被机体接纳。研制一种与天然骨组织结构、性能相一致的骨替代材料，一直是骨组织工程材料研究的目标。天然骨是由无机和有机基质巧妙结合在一起形成的天然复合体，其中无机质大部分是羟基磷灰石(HAP)，有机质大部分是纤维性胶原蛋白和少量多糖。从广义上说，它可近似看作以骨胶原为基体材料、羟基磷灰石为增强材料而构成的有机-无机复合材料。基于此，胶原基纳米羟基磷灰石类复合材料成为了近年来骨材料研究的热点之一。但由于该类材料存在机械性能差和降解速率过快，无法与骨生长速度很好地匹配等缺点，使其难以单独成为良好的骨组织工程支架。近几年来，研究者们通过仿生合成、交联处理、引入第三相等方法来提高胶原基纳米羟基磷灰石复合材料的性能。壳聚糖是一种带正电荷的天然聚多糖，其结构与细胞外基质的主要成分一糖胺聚糖十分类似，降解产物对人体无毒副作用，具有良好的生物降解性和生物相容性。在外形方面，壳聚糖可制成管状、膜、片、微粒等多种形状的多孔材料，已广泛应用于生物领域。壳聚糖的力学性能强于胶原，在体液环境中降解速率能满足骨组织工程的需要，并且能和胶原很好的复合，增加胶原的稳定性。透明质酸(HYA)是细胞外基质中的一种重要天然多糖，具有高度含水能力，可以特异地与CD44受体结合，在调节细胞行为方面有重要作用。在胶原中复合透明质酸，可以利用其优越的生物功能，促进细胞分化与增殖，有助于得到新生组织。基于此，本专利技术利用壳聚糖、透明质酸、胶原的分子交联技术和纳米羟基磷灰石的自组装仿生学原理结合冷冻干燥相分离技术，在成分仿生的基础上进行结构仿生制备类似天然骨组织细胞外基质的人工骨缺损修复支架。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架及其制备方法。本专利技术制得的三维立体多孔支架具有较大孔隙率和微米/纳米多级孔径结构，有利于细胞粘附生长、细胞外基质沉淀、营养与氧气进入、代谢产物的排出；支架上含有细胞特异性识别位点，有利于细胞粘附、生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞的表型表达。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 从仿生角度出发，选用壳聚糖、胶原、透明质酸和羟基磷灰石组分的组合，利用冷冻干燥相分离技术结合原位复合方法，在成分仿生的基础上进行结构仿生制备类似天然骨组织细胞外基质的人工骨缺损修复支架。多级孔径结构是指纳米复合骨缺损修复支架具有微米级、纳米级的多级孔径分布。一种制备如上所述的具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架的方法包括以下步骤: (1)将透明质酸溶解于去离子水中，壳聚糖和胶原溶解于体积分数为I 2%的乙酸溶液中； (2)缓慢将透明质酸溶液加入到壳聚糖/胶原的乙酸溶液中，搅拌0.5 lh，使其充分混合均勻； (3)在剧烈搅拌下，按照HAP的化学计量比Ca/P= 1.67在步骤(2)的混合溶液中分别加入2 3mol/L可溶性钙盐溶液和1.2 1.8mol/L可溶性磷酸盐溶液； (4)往步骤(3)的混合溶液中加入交联剂，常温交联4 8h，最终混合液注入模具，移至2 4°C冰箱预冷冻3 5h，再放入-10 -80°C冷冻至少12h ； (5)将步骤(4)所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水； (6)将步骤(5)的干燥样品置于0.5 1.5mol/L的碱溶液中浸泡8 15h,再用去离子水反复浸洗至中性，-10 _80°C冷藏后进行冷冻干燥，即得到具有多级孔径结构的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/胶原/透明质酸骨缺损修复支架。步骤(3)所述的可溶性钙盐是硝酸钙或氯化钙，可溶性磷酸盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。步骤(I)所述的胶原为I型活性胶原蛋白，透明质酸选用它的钠盐。步骤(3)的可溶性钙盐溶液和可溶性磷酸盐溶液，二者间隔20 40min加入。步骤(4)所述的交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS);交联剂EDC的浓度为2 4mg/mL，NHS的浓度为I 3mg/mL。步骤(6)的碱溶液是0.5 1.5mol/L KOH或NaOH的乙醇/水(v: V=I 2:1)溶液。步骤(4)的最终混合液中，壳聚糖的浓度为16 20g/L，胶原的浓度为2.5 5 g/L，透明质酸的浓度为0.5 1.5 g/L，加入的Ca/P前驱体溶液理论形成HAP量为10 20g/L。本专利技术的显著优点在于:壳聚糖在组成和结构上与糖胺聚糖具有部分相似性，且生物相容性好；透明质酸是一种糖胺聚糖，存在于细胞外基质中，具有保湿、促进离子溶质和营养物质运输的功能，能通过与其他基质分子相互作用，保持细胞外基质的稳定性和弹性；胶原蛋白是细胞外基质的重要成分之一，本身含有RGD生物活性短肽，可特异性识别并与细胞表面整连蛋白受体键合，促进细胞 的黏附与生长。原位形成的羟基磷灰石类似人体内生物矿化生成的羟基磷灰石，无毒、安全、具有良好的生物相容性、骨传导性。因此，选用壳聚糖/胶原/透明质酸为有机基质，可溶性钙盐和可溶性磷酸盐为无机相纳米羟基磷灰石的先驱物，采用冷冻干燥相分离技术原位构筑与人体骨组织细胞外基质相近的人工骨缺损修复支架，相对于其他骨缺损修复支架有以下优点: (1)纳米羟基磷灰石/壳聚糖/胶原/透明质酸骨缺损修复支架含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)序列，可特异性识别并与细胞表面整连蛋白受体键合，促进细胞的黏附与生长; (2)纳米羟基磷灰石/壳聚糖/胶原/透明质酸骨缺损修复支架具有微米级、纳米级的多级孔径结构；这种多级孔径结构有利于细胞的附着、铺展、迁移，培养液和代谢产物的运输及交换，从而有利于细胞生长； (3)采用原位复合的制备方法，使得羟基磷灰石在支架上实现了纳米级分散，相界面的结合力得到加强，改善了支架的力学性能； (4)可以通过改变交联剂的用量来控制交联度，得到具有不同生物降解性能和力学性能的复合支架； (5)该复合支架的制备工艺条件温和，操作方便。附图说明图1-3具有多级孔径结构的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/胶原/透明质酸骨缺损修复支架的SEM扫描电子显微镜图。图4是具有多级孔径结构的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/胶原/透明质酸骨缺损修复支架图3的放大图(箭头所指是支架上的纳米颗粒)。图5是具有多级孔径结构的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/胶原/透明质酸骨缺损修复支架上附着的纳米粒的XRD衍射图谱。图6具有多级孔径结构的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/胶原/透明质酸骨缺损修复支架的Hoechst33258荧光染色图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架，其特征在于：从仿生角度出发，选用壳聚糖、胶原、透明质酸和羟基磷灰石组分的组合，利用冷冻干燥相分离技术结合原位复合方法，在成分仿生的基础上进行结构仿生制备类似天然骨组织细胞外基质的人工骨缺损修复支架。
【技术特征摘要】
1.一种具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架，其特征在于:从仿生角度出发，选用壳聚糖、胶原、透明质酸和羟基磷灰石组分的组合，利用冷冻干燥相分离技术结合原位复合方法，在成分仿生的基础上进行结构仿生制备类似天然骨组织细胞外基质的人工骨缺损修复支架。2.根据权利要求1所述的具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架，其特征在于:以壳聚糖、胶原、透明质酸为有机相，可溶性钙盐和可溶性磷酸盐为无机相纳米羟基磷灰石的先驱物。3.根据权利要求1所述的具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架，其特征在于:多级孔径结构是指纳米复合骨缺损修复支架具有微米级、纳米级的多级孔径分布。4.一种制备如权利要求1所述的具有多级孔径结构的纳米复合骨缺损修复支架的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)将透明质酸溶解于去离子水中，壳聚糖和胶原溶解于体积分数为I 2%的乙酸溶液中； (2)缓慢将透明质酸溶液加入到壳聚糖/胶原的乙酸溶液中，搅拌0.5 lh，使其充分混合均勻； (3)在剧烈搅拌下，按照HAP的化学计量比Ca/P= 1.67在步骤(2)的混合溶液中分别加入2 3mol/L可溶性钙盐溶液和1.2 1.8mol/L可溶性磷酸盐溶液； (4)往步骤(3)的混合溶液中加入交联剂，常温交联4 8h，最终混合液注入模具，移至2 4°C冰箱预冷冻3 5h，再放入-10 -80°C冷冻至少12h ； (5)将步骤(4)所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水； (6)将步骤(5)的干燥样品置于0.5 1.5mol/L的碱溶液中浸泡8 15h,再用去离子水反复浸洗至中性，-10 _80°C...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈景帝，余其凤，张惠，张玉珏，张其清，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：
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