黄瓜高分辨率染色体荧光原位杂交的方法技术

本发明专利技术提供了一种荧光原位杂交的方法，以黄瓜减数分裂粗线期染色体为靶DNA进行多探针的荧光原位杂交。精选染色体分散良好且形态结构清晰的高质量制片，在80℃的70％去离子甲酰胺中变性，梯度酒精中脱水干燥；采用碱裂解法提取目标质粒DNA，利用缺刻平移法进行标记，配制杂交混合液，90℃变性后，加到载玻片上使靶DNA与探针进行杂交，最后进行信号检测。本发明专利技术的荧光原位杂交技术，可用于黄瓜染色体物理图谱的绘制，由于其一次性可加入多个探针，避免了对一张制片多次重复杂交，大大提高了实验效率。本发明专利技术在配置杂交混合液的过程中加入了适量的黄瓜全基因组DNA和Cot-1DNA，用于封阻杂信号和重复序列信号，提高了靶信号的辨识率，增加了实验结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了黄瓜高分辨率染色体的荧光原位杂交方法，专用于进行黄瓜的粗线期染色体的荧光原位杂交，有利于开展黄瓜的细胞学研究，属于植物生物

技术介绍
黄瓜(Cucumis sativus L., 2n = 14)又名胡瓜,青瓜,是葫芦科甜瓜属一种蔓生草本植物，原产于喜马拉雅山南麓热带地区，是世界性蔬菜作物之一。因其果实鲜美，营养丰富，且具有抗肿瘤、抗衰老、减肥强体、健脑安神等功效而深受广大消费者的喜爱。专利技术和利用黄瓜的粗线期染色体为靶DNA进行荧光原位杂交，是近年来细胞学领域的一大重要进展。目前，只有少数的报道中是以黄瓜的粗线期染色体为靶DNA进行荧光原位杂交的。针对以往的利用黄瓜的间期核或中期染色体为靶DNA进行荧光原位杂交，由于黄瓜染色体小、中期染色体的染色质浓缩度高、染色体粗短，致使定位其上的信号辨识率不高；另一方面，由于在杂交过程中会有背景信号或重复序列信号的干扰，会对目标信号的检测产生不利影响。利用粗线期染色体为靶DNA，粗线期染色体已完成了同源染色体配对，与有丝分裂中期染色体相比，染色质更为疏松，其长度通常比相应的中期染色体大10 20倍，同时由于每个位点有两份同源拷贝，大大提高了目标信号的辨识率；并且在本专利技术中，在配制杂交混合液的过程中增加了黄瓜全基因组DNA和Cot-1DNA，对杂交过程中产生的背景信号和重复序列信号进行了一定程度上的封阻，便于目标信号的检测，增加了实验结果的可靠性。
技术实现思路
技术问题本专利技术黄瓜高分辨率 染色体的制片方法的目的是针对利用黄瓜中期染色体为靶DNA进行荧光原位杂交时，其染色质浓缩度高，染色体粗短，致使定位在其上的信号辨识率不高，而利用粗线期染色体为靶DNA，大大地提高了目标信号的辨识率；另一方面，针对以往的在杂交过程中产生的背景信号和重复序列信号会干扰目标信号的检测，加入一定量的黄瓜全基因组DNA和CJ-1DNA有效的封阻了杂质信号，提高了实验结果的可靠度。技术方案本专利技术所提供的黄瓜高分辨率染色体的荧光原位杂交，其特征在于:得到了能同时清晰分辨出多个探针的粗线期染色体荧光原位杂交的方法，大大提高了探针的辨识率，加快了实验进程。上述粗线期染色体荧光原位杂交，是通过以下方法获得的:取黄瓜花蕾，放入体积比为3:1的E: G(乙醇:冰醋酸)固定液中固定备用。从花蕾中剥出花药，用酶解去壁低渗法进行染色体制片，镜检，精选染色体分散良好、形态结构清晰的高质量染色体制片备用。喊裂解法提取质粒DNA,用 Dig-Nick Translation Kit 和 Biotin-NickTranslation Kit对质粒DNA进行标记。精选的染色体制片，在80°C的70 %去离子甲酰胺中变性，依次放入70 %、90 %和100%的酒精中脱水，晾干。配杂交混合液，90°C变性后，加在载玻片上37°C杂交过夜。杂交后先用2倍柠檬酸钠氯化钠缓冲液(2 X SSC)和I倍TNT (I X TNT)浸洗后，力口抗地高辛荧光素抗体和抗生物素荧光素抗体，37°C黑暗反应40min，反应结束后用IXTNT浸洗 3X5min。染色体制片用2ug/ml的DAPI复染，在荧光显微镜下观察荧光原位杂交信号。有益效果本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和积极效果:I)利用黄瓜的粗线期染色体为靶DNA进行荧光原位杂交，在材料准备方面，可以直接在盛花前期或盛花期的黄瓜植株上取花蕾，固定备用，省去了单独利用黄瓜种子催芽取黄瓜根尖，预处理后再固定，用来制备中期染色体，节约了黄瓜种子。2)黄瓜粗线期染色体(图1)的染色质浓缩度比中期染色体要小，染色质更为疏松，其长度通常比相应的中期染色体(图2)大10 20倍，染色体伸展开来，便于探针渗入。3)粗线期染色体具有许多在中期染色体上难以辨认的标记，如粗线期染色体上常染色质，异染色质，染色粒明显不同的分布。4)黄瓜中期染色体粗短，在做荧光原位杂交时，若同时加入多个探针，信号会重叠(图3)，难以区分信号在染色体上的相对位置，而粗线期染色体分散开来，同时加入多个探针也能区分它们在染色体 上的相对位置(图4)，这样减少了重复杂交的次数，加快了实验进程。5)在配制杂交混合液的过程中，加入适量的黄瓜全基因组DNA和CJ-1DNA，有效地封阻了在杂交过程中产生的背景信号，便于目标信号的检测，提高了实验结果的准确度。四附图说明图1:黄瓜粗线期染色体，染色体的分散度高，能清晰的分辨出每条染色体，也能直接观察到染色体上染色较深的异染色质区。图2:黄瓜中期染色体，染色体粗短，无法辨别染色体上的异染色质区和着丝粒位点。图3:黄瓜三号染色体上10个Fosmid克隆在中期染色体上的分布，由于染色体粗短，无法分辨出多个信号的具体位置和排列顺序。图4:黄瓜三号染色体上10个Fosmid克隆在粗线期染色体上的分布,能清晰的分辨出目标信号在染色体上的分布，也可以观察出探针在染色体上的排列顺序。五具体实施例方式本专利技术黄瓜高分辨率染色体荧光原位杂交的实施程序包括:(I)材料的准备:在黄瓜盛花前期或盛花期取适当大小的花蕾，放入体积比为3:1的E: G(乙醇:冰醋酸)固定液中固定一个星期，一个星期后将花蕾换到70%的乙醇中，备用。(2)粗线期染色体制片:采用酶解去壁低渗法进行染色体制片，在普通显微镜下镜检，精选形态良好且不相互重叠的高质量的染色体载玻片备用。(3)质粒DNA探针的标记:采用碱裂解法提取质粒DNA,用Dig-Nick TranslationKit 和 Biotin-Nick Translation Kit 进行标记。(4)原位杂交:精选的黄瓜粗线期染色体制片，在80°C的70%去离子甲酰胺中变性1.5min，立即转入-20°C下预冷的70%酒精、常温下90%和100%的酒精中脱水各5min，空气中充分干燥。在染色体变性的同时配制杂交混合液，在配制杂交混合液时，可同时加入多个探针，并且加入适量的黄瓜全基因组DNA和Qt-1DNA，用于封阻在杂交过程中产生的背景信号和重复序列信号，90°C变性6min,立即置于冰上至少6min。加杂交混合液和盖玻片于载玻片上，将载玻片置于保湿盒中37°C恒温过夜。(5)杂交信号的荧光检测:杂交后先用2倍柠檬酸钠氯化钠缓冲液(2XSSC)依次在室温下和42°C下浸洗5min和lOmin，接着在室温下用2XSSC浸洗3次，用I倍三硝基甲苯(IXTNT)浸洗I次，各5min。然后加抗地高辛荧光素抗体和抗生物素荧光素抗体，37°C黑暗反应40min，反应结束后用I X TNT浸洗3次，每次5min。(6)图像镜检:染色 体制片用2ug/ml的DAPI复染，在荧光显微镜下观察荧光原位杂交信号。本文档来自技高网...

【技术保护点】
黄瓜高分辨率染色体荧光原位杂交是基于减数分裂粗线期染色体进行，其特征在于：得到了能清晰分辨出多达10个探针的高分辨率粗线期染色体荧光原位杂交的方法，大大提高了靶信号的辨识率。

【技术特征摘要】
1.黄瓜高分辨率染色体荧光原位杂交是基于减数分裂粗线期染色体进行，其特征在于: 得到了能清晰分辨出多达10个探针的高分辨率粗线期染色体荧光原位杂交的方法，大大提高了靶信号的辨识率。2.根据权利要求1所述的得到的能清晰分辨出的多个探针的粗线期染色体荧光原位杂交，这多个探针是一次性...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄群峰，何玉华，陈劲枫，程春燕，张云霞，李季，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：