一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，其特征在于包括如下步骤：①配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液；②湿沙准备；③播种；④培养。本发明专利技术在适宜抗生素选择压力下，利用转Bt基因植株带有的新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因作标记所编码的产物可使卡那霉素等氨基糖苷类抗生素失活而能够正常生长，而非转Bt基因植株因不含有nptⅡ基因作标记而不能够正常生长的机制，在测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时可以检测抗虫性纯度。本发明专利技术操作简单易行，费用低，其检测准确度达到100%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及转基因植物检测，涉及一种同时测定转基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，更具体的说是一种测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时，通过喷洒一定浓度的抗生素溶液检测抗虫性纯度的方法。
技术介绍
转Bt基因抗虫棉已在生产上被广泛应用，并有效地控制了棉铃虫的危害。然而抗虫棉的抗虫性纯度直接影响着棉花的产量和品质，因此在棉花生产和经营中进行棉花种子的抗虫性检测是必不可少的环节。早在1998年中国农业大学的王保民等就已经开始利用双抗夹心ELISA检测方法对抗虫棉Bt杀虫晶体蛋白进行检测研究，并取得了初步效果。王坤波等(2000年)在苗床对转Bt基因抗虫棉子叶用卡那霉素溶液涂抹或浸润的方法进行了抗虫性研究，马丽华等(2000年)对转Bt基因抗虫棉子叶用卡那霉素溶液涂抹或浸润的方法进行了田间抗虫性研究，都取得了很好的效果。目前对转Bt基因抗虫棉的抗虫性纯度的常用测定方法主要有卡那霉素抗性基因田间种植检测法和试纸条法。卡那霉素抗性基因田间种植检测法主要是采取叶片涂抹的方法，在大田播种出苗后，用硫酸卡那霉素溶液涂抹子叶或真叶来检测种子的抗虫性，这种田间种植检测的方法需要在大田种植，对于棉花种子的经营者来说，通常需要延缓一个种植季节出售；而试纸条法则是通过检测毒蛋白来检测棉花中的抗虫性，快速、简便易行，但费用高，每百粒棉种仅试纸成本就得600-700元，因此该方法可作小范围急用使用，大规模生产经营的棉种企业或种植户不常使用。另外，检测转Bt基因抗虫棉的抗虫性纯度的方法还有PCR检测、Southern和Northern杂交、卡那霉素抗性室内基因鉴定、Gus基因检测、ELISA快速定量检测等，这些方法检测时间短，但需专业技术人员来操作，是科研单位实验室常用的方法。上述无论哪种检测方法都只能检测棉花种子的抗虫性，而对于棉花种子生产和销售者来说，在进行种子抗虫性检测的同时还往往需要另外再通过目测法、沙床培养法、毛巾培养法、恒温箱培养法等进行种子的发芽率的检测。
技术实现思路
为了避免上述现有检测技术的缺陷，本专利技术在适宜抗生素选择压力下，利用转Bt基因植株带有的新霉素磷酸转移酶(npt II )基因作标记所编码的产物可使卡那霉素等氨基糖苷类抗生素失活而能够正常生长，而非转Bt基因植株因不含有npt II基因作标记而不能够正常生长的机制，专利技术了。本专利技术提供了，包括如下步骤:1、配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液；2、湿沙准备:选择干净河沙与水按6-8:1比例拌匀备用；3、播种:将步骤2准备的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度2_4cm ;在湿沙上均匀摆放待检测的棉花种子100粒，种子间距不小于1.5cm ;然后再在种子上面覆上厚3-4cm步骤2准备的湿沙，压实；塑料盆顶上盖一层塑料薄膜；4、培养:将步骤3中播好种子的塑料盆摆放在安装日光灯的室内，光照时间12小时/天，室内温度20°C -30°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在湿沙表面均匀喷洒300mL步骤I中制备的硫酸卡那霉素水溶液;第5天开始每隔2-3天给湿沙喷水，防止湿沙表面变干；第7天统计发芽率，第13-15天观察抗虫性。苗势壮、叶色深绿的为抗虫株；苗势弱、子叶有黄斑或子叶全部变黄的为非抗虫植株。步骤I中配制的是0.4%的硫酸卡那霉素水溶液。 步骤2中选择干净河沙与水按7:1比例拌匀备用。步骤3中将步骤2所述的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度3cm ;在湿沙上均匀摆放待检测的棉花种子100粒，种子间距为1.5cm ;然后再在种子上面再覆上厚3cm步骤2所述的湿沙，压实；用一层塑料薄膜封住盆口。步骤4中所述的室内温度为26V。本专利技术的有益效果在于:1、操作简单易行:设备简单，一般人员都能操作；2、费用低，检测100粒棉种所用试剂费用约为试纸条法的1.5% ;3、本专利技术在检测转Bt基因棉花种子发芽率的同时可以检测棉花种子的抗虫性纯度；4、本方法的检测准确度达到100%。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述，但不以任何方式限制本专利技术的范围。具体实施例方式实施例中所用硫酸卡那霉素粉剂(纯度100%)购于上海生工生物工程技术服务有限公司，所用转Bt基因抗虫棉品种冀1316和非抗虫棉品种冀棉25的种子均由本所提供。实施例1:喷洒0.4%的硫酸卡那霉素水溶液测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时测定抗虫性纯度1,0.4%硫酸卡那霉素水溶液的配制:称取硫酸卡那霉素粉末试剂4g、蒸馏水1L，配制成0.4%的硫酸卡那霉素水溶液；2、湿沙的准备:选择干净河沙与水按7:1比例拌匀备用，湿沙以手攥能成团，松开后微散为宜；3、播种:将步骤2准备的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度3cm ;在不同所料盆的湿沙上均匀摆放转Bt基因抗虫棉冀1316种子和非抗虫棉品种冀棉25的种子各100粒，种子间距1.5cm ;然后再在种子上面覆上厚3cm步骤2准备的湿沙，压实；用一层塑料薄膜封住盆口；4、培养:将步骤3中播好种子的塑料盆摆放在安装日光灯的室内，光照时间12小时/天，室内温度26°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在湿沙表面均匀喷洒300mL步骤I中制备的硫酸卡那霉素水溶液，以喷洒蒸馏水为对照；第5天开始每隔2天给湿沙喷水，防止湿沙表面变干;第7天开始观察发芽率，第14天观察抗虫性。统计处理组和对照组的种子的发芽率。结果处理组和对照组中的转Bt基因抗虫棉冀1316种子有89粒种子发芽长成植株，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子中有86粒种子发芽长成植株，说明转Bt基因抗虫棉冀1316种子发芽率为89%，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子发芽率为86%。观察处理组和对照组抗虫性，发现转Bt基因抗虫棉冀1316种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿，初步判断冀1316种子抗虫性纯度为100%。而非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子喷洒了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗势弱、子叶有黄斑或全部变黄，说明冀棉25对硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗虫，喷洒蒸馏水的冀棉25种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿。实施例2:喷洒0.45%的硫酸卡那霉素水溶液测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时测定抗虫性纯度按实施例1步骤I中的方法配制0.45%硫酸卡那霉素水溶液，步骤3中在塑料盆底部均匀铺上2cm厚的湿沙，步骤4中培养温度为30°C并第15天观察抗虫性，其余步骤与实施例1相同。统计处理组和对照组的种子的发芽率。结果处理组和对照组中的转Bt基因抗虫棉冀1316种子有88粒种子发芽长成植株，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子中有86粒种子发芽长成植株，说明转Bt基因抗虫棉冀1316种子发芽率为88%，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子发芽率为86%。观察处理组和对照组抗虫性，发现转Bt基因抗虫棉冀1316种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿，初步判断冀1316种子抗虫性纯度为100%。而非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子喷洒了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗势弱、子叶有黄斑或全部变黄，说明冀棉25对硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗虫，喷洒蒸馏水的冀棉25种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿。实施例3:喷洒0.5%的硫酸卡那霉素水溶液测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时测定抗虫性纯度按实施例1步骤I中的方法配制0.5%本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，其特征在于包括如下步骤：①配制0.4%?0.6%硫酸卡那霉素水溶液；②湿沙准备：选择干净河沙与水按6?8:1比例拌匀备用；③播种：将步骤②准备的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度2?4cm；在湿沙上均匀摆放待检测的棉花种子100粒，种子间距不小于1.5cm；然后再在种子上面覆上厚3?4cm步骤②准备的湿沙，压实；塑料盆顶上盖一层塑料薄膜；④培养：将步骤③中播好种子的塑料盆摆放在安装日光灯的室内，光照时间12小时/天，室内温度20℃?30℃；第3天揭掉塑料薄膜，在湿沙表面均匀喷洒300mL步骤①中制备的硫酸卡那霉素水溶液；第5天开始每隔2?3天给湿沙喷水，防止湿沙表面变干；第7天统计发芽率，第13?15天观察抗虫性；苗势壮、叶色深绿的为抗虫株；苗势弱、子叶有黄斑或子叶全部变黄的为非抗虫植株。

【技术特征摘要】
1.一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，其特征在于包括如下步骤: ①配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液； ②湿沙准备:选择干净河沙与水按6-8:1比例拌匀备用； ③播种:将步骤②准备的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度2-4cm;在湿沙上均匀摆放待检测的棉花种子100粒，种子间距不小于1.5cm ;然后再在种子上面覆上厚3-4cm步骤②准备的湿沙，压实；塑料盆顶上盖一层塑料薄膜； ④培养:将步骤③中播好种子的塑料盆摆放在安装日光灯的室内，光照时间12小时/天，室内温度20°C -30°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在湿沙表面均匀喷洒300mL步骤①中制备的硫酸卡那霉素水溶液；第5天开始每隔2-3天给湿沙喷水，防止湿沙表面变干；第7天统计发芽率，第13...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯辉，郭宝生，耿军义，刘素恩，赵存鹏，马玉柱，耿香利，刘敏彦，
申请(专利权)人：河北省农林科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：