具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于制备和使用所述多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有β -葡糖苷酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。相关领域描述纤维素是葡萄糖通过β -1, 4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β -连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖`酶、纤维二糖水解酶和葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开(opening it)以受到纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶顺序地从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势:大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。因为葡萄糖容易通过多种酵母发酵为乙醇而纤维二糖则否，所以任何在水解结束时剩余的纤维二糖代表乙醇得率(yield)的损失。更重要的是，纤维二糖是内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的强力抑制剂。在水解过程中纤维二糖的累积对于乙醇产生是不希望的。纤维二糖累积在酶水解中是严重的问题，因为纤维素酶产生微生物可能几乎不产生葡糖苷酶。葡糖苷酶的低水平导致将纤维二糖水解为葡萄糖的能力的缺乏。已使用几种方法增加纤维素转化中β_葡糖苷酶的量。一种方法是使用几乎不产生纤维素酶的微生物产生β -葡糖苷酶，并将β -葡糖苷酶外源地添加至内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶以增强水解。第二种方法是在发酵同时进行纤维素水解。该工艺称为同时糖化和发酵(SSF)。在SSF系统中，葡萄糖的发酵将其从溶液去除。第三种克服β -葡糖苷酶的缺乏的方法是在宿主中过表达β -葡糖苷酶，由此增加葡糖苷酶的产率。在本领域中，提供用于降解纤维素材料的新的β -葡糖苷酶会是优点。本专利技术提供了具有β -葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。专利技术概述本专利技术涉及具有β_葡糖苷酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组:(a)多肽，其与SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少85%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%序列同一性；(d)SEQ ID N0:2的成熟多肽的包含在一个或多个(例如几个)位置的取代、缺失和/或插入的变体；和(e) (a)、(b)、(c)或⑷的多肽具有β _葡糖苷酶活性的片段。本专利技术还涉及编码本专利技术的多肽的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，和产生所述多肽的方法。本专利技术还涉及使用本专利技术的多肽的方法。本专利技术还涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含或组成为(consistingof) SEQ ID NO: 2的氨基酸I至21，其可操作地连接于编码蛋白的基因；涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并涉及产生蛋白的方法。附图简述附图说明图1A 和 IB 显不草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株 IBT5387 GH3 β -葡糖苷酶基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO:1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。内含子以斜体表示。图2显示pUC19 D55EX的限制图谱。定义β -葡糖苷酶:术语“ β -葡糖苷酶”意指β -D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase) (E.C.N0.3.2.1.21)，其催化末端非还原 β -D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本专利技术而言，葡糖苷酶活性是根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophiIum!production, purification and some biochemical properties,J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法确定的。一个单位的β -葡糖苷酶定义为在40°C，pH5,在含有0.01%TWEEN 20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯，polyoxyethylene sorbitanmonolaurate)的50mM乙酸钠中从作为底物的0.8mM对硝基苯基-β -D-葡糖卩比喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。本专利技术的多肽具有SEQ ID NO: 2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少100%的β -葡糖苷酶活性。乙酰木聚糖酯酶:术语“ 乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸Ct-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本专利技术而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEEN 20的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5, 25°C每分钟释放I微摩尔对硝基苯酌.阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。等位变体(allelic variant):术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶:术语“ a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶”意指a _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对a -L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性a -L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对a -L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)_键的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本专利技术而言，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200 μ I中的每ml的IOOmM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(MegazymeInternational Ireland, Ltd., Bray, C0.Wicklow, Ireland)在 4CTC进行 30 分钟，接着通过AiVlINEX本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有β‑葡糖苷酶活性的分离的多肽，其选自下组：(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，和100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，和100%序列同一性；(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的包含在一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有β‑葡糖苷酶活性的片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.30 US 61/360,3511.一种具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽，其选自下组: (a)多肽，其与SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%,至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%,至少98%,至少99%,和100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长互补链； (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%，例如至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，和100%序列同一I生； (d)SEQID NO:2的成熟多肽的包含在一个或多个位置的取代、缺失和/或插入的变体；和 (e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有β -葡糖苷酶活性的片段。2.权利要求1的多肽，其包含或组成为SEQID NO:2或其成熟多肽。3.权利要求1或2的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含于质粒pUC19D55EX，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL Β-50395。4.一种组合物,其包含权利要求1-3任一项的多肽。5.—种分离的多核苷酸,其编码权利要求1-3任一项的多肽。`6.—种产生权利要求1-3中任一项的多肽的方法,其包括:(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和 (b)回收所述多肽。7.—种产生具有β_葡糖苷酶活性的多肽的方法，其包括: (a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含权利要求5的多核苷酸的宿主细胞；和 (b)回收所述多肽。8.—种转基...

【专利技术属性】
技术研发人员：M莫兰特，S帕特卡，H丁，
申请(专利权)人：诺维信公司， 诺维信股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK