本发明专利技术提供编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用，属于分子生物学领域。编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID NO:1所示的序列。本发明专利技术还提供含有上述基因的重组表达载体，含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。该复合物制备方法为：培养重组菌，破碎获得裂解液上清，纯化后获得含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。本发明专利技术将Cap蛋白编码基因进行了密码子优化，所以重组Cap蛋白能够高产、高效、可溶表达；由于上述复合物含有肽聚糖锚钩蛋白PA，有利于后续纯化。本发明专利技术重组猪圆环病毒2型Cap蛋白活性良好，含有该重组蛋白的复合物免疫小鼠后可产生高水平的猪圆环病毒2型特异性抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及ー种重组猪圆环病毒2型(PCV2) Cap蛋白的方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PWMS)的主要病原，它不但可以导致断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天性震颤(All，CT)、怀孕母猪流产、成年猪皮炎肾炎综合征(PDNS)和呼吸道疾病综合征(PRDS)密切相关。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中流行十分严重，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。在2010年国际猪兽医大会(IPVS)上，猪圆环病毒感染成为关注度最高的疾病，是全球公认的危害养猪业的重要传染病之一。近年来，国内猪圆环病毒感染呈上升趋势。PCV2含有两个主要的开放阅读框:0RF1和0RF2，ORFl编码两种复制酶蛋白，參与病毒复制；0RF2编码核衣壳蛋白Cap，是病毒主要的免疫原性蛋白。McNeiUy等研究证实Cap蛋白免疫动物可以产生病毒的中和抗体。0RF2基因已经作为研制基因工程疫苗的重点对象。众所周知，PCV2的检测是防控PCV2相关疾病的重要组成部分。现行的PCV2检测方法包括有PCR、免疫组化、原位杂交和ELISA技术等。ELISA技术具有高特异性、敏感性，操作简单、方便易行，便于大量样品检测的优点。Cap蛋白作为PCV2主要的免疫原性蛋白，可作为PCV2 ELISA检测的诊断抗原。因此，获得高纯度的Cap蛋白是建立PCV2 ELISA检测的关键。 但是，现有技术中Cap蛋白采用真核表达系统产量低，分离纯化困难；而进行原核表达则多以无活性的包涵体形式存在，所以Cap蛋白难以规模化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，易于可溶性表达。本专利技术的另ー目的是提供含有上述基因的重组表达载体。本专利技术的另一目的是提供含有上述基因的重组菌，目的蛋白的表达量高，表达产物易于纯化。本专利技术的再一目的是提供含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，该复合物具有良好的免疫原性，生产效率高，易于纯化，制备方法简单，易于规模化生产。本专利技术的目的采用如下技术方案实现: 编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID N0:1所示的序列。 还含有肽聚糖锚钩PA蛋白的编码基因。所述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3所示。ー种含有上述基因的重组表达载体。该重组表达载体是将所述基因插入pET_32a的Nde I和Xho I两个酶切位点之间所得。含有上述基因的重组菌。所述重组菌是将所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21所得。ー种含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，采用如下方法制备:培养所述重组菌，破碎后获得裂解液上清，纯化后获得含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。所述纯化方法为:将乳酸乳球菌用酸煮沸后得到革兰氏阳性增强基质颗粒；将革兰氏阳性增强基质颗粒加入裂解液上清中进行吸附，离心后取沉淀即得所述复合物。革兰氏阳性增强基质颗粒缩写为GEM颗粒。所述酸为盐酸；革兰氏阳性增强基质颗粒的加入量为:含有0.5 2毫克蛋白的裂解液上清中加入2.5X IO9个革兰氏阳性增强基质颗粒。一种所述复合物在制备猪圆环病毒疫苗和猪圆环病毒诊断试剂盒方面的应用。本专利技术相对于现有技术方法的有益效果: 1.本专利技术将猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因进行了密码子优化，所以重组猪圆环病毒2型Cap蛋白能够高产、高效、可溶表达，解决了 Cap蛋白在真核细胞中表达量低，在原核细胞中表达无活性的难题。由于大肠杆菌原核表达系统比较成熟，所以操作简单。2.本专利技术重组猪圆环病毒2型Cap蛋白含有肽聚糖锚钩蛋白PA，可以与GEM颗粒相结合，有利于后续纯化，生产成本低，易于规模化生产。3.本专利技术重组猪圆环病毒2型Cap蛋白活性良好，含有该重组蛋白的复合物免疫小鼠后可产生高水平的猪圆环病毒2型特异性抗体。因此，含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物可用于制备猪圆环病毒2型的诊断试剂盒及猪圆环病毒2型亚单位疫苗。附图说明 图1是肽聚糖锚钩PA蛋白基因PCR扩增产物电泳图，其中M为DNA Marker, I为纯水对照，2为肽聚糖锚钩PA蛋白的基因扩增产物。图2是重组质粒酶切鉴定结果，其中M为DNA Marker,泳道I为质粒PET_32a的双酶切产物；2为阳性重组质粒的双酶切产物。图3(A)和图3(B)为重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的SDS-PAGE分析图；其中M为蛋白相对分子量Marker ;图3(A)中，泳道I和2均为诱导表达的重组表达菌株BL21_Cap_PA的裂解液上清；3为诱导表达的对照菌株的裂解液上清；图3 (B)中，泳道I为未诱导表达的重组表达菌株BL21-Cap-PA全菌；泳道2为诱导表达的重组表达菌株BL21_Cap_PA全菌；泳道3为诱导表达的重组表达菌株BL21-Cap-PA裂解液上清；泳道4为诱导表达的重组表达菌株BL21-Cap-PA裂解液沉淀。图4:重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的Western Blot鉴定结果，其中M为蛋白相对分子量Marker ；1为诱导表达的重组表达菌株BL21_Cap_PA裂解液上清；2为诱导表达的对照菌裂解液上清。图5 (A)和图5 (B)是乳酸乳球菌MG1363和GEM颗粒的透射电镜图，其中图5 (A)为乳酸乳球菌MG1363，图5 (B)为GEM颗粒。图6是含重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白相对分子量Marker，泳道I为含重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，泳道2为GEM颗粒。图7 (A)和图7 (B)是GEM颗粒和含重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物的电镜图，其中图7 (A)为GEM颗粒，图7 (B)为含重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。图8是各组小鼠免疫后的血清抗体水平。具体实施例方式 肽聚糖锚钩PA蛋白是作为纯化标签而设计的，可以处于重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的N端或C端，对其表达量、抗原性及疫苗免疫后抗体水平没有影响。实施例1肽聚糖锚钩PA蛋白、Cap蛋白基因片段及原核表达质粒的构建 1.肽聚糖锚钩PA蛋白基因片段的获得 (I)引物设计 根据乳酸乳球菌MG1363的基因序列(U17696.1)，设计引物PAF (SEQ ID N0:4)和PAR(SEQ ID NO:5)，扩增其肽聚糖锚钩PA蛋白的基因片段。PAF 的序列为:5’ -ACTACTTATACCGTCAAATC-3’ ； PAR 的序列为:5’ -TITTAITCGTAGATACTGAC-3’。(2) PCR扩增目的片段 采用常规方法培养乳酸乳球菌MG1363，收获菌体。采用RNAiso Plus (Takara)提取RNA，应用随机引物反转录成cDNA作为PCR反应模板。反转录的体系及反应程序:每份模板(3 4ug)加入随机引物1W，11.75WRnase free H2O,低速瞬离，然后在70 °C条件下保温IOmin ;再冰浴2min,低速瞬离，カロ入 2M-1 5 XM - MLV b uffer, 0.5M-1 dNTP Mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其特征在于：含有SEQ ID NO:1所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏成，郑其升，乔绪稳，陈瑾，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。