本发明专利技术公开了含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部，并且与堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)基因的核酸序列杂交的寡核苷酸、含有该寡核苷酸的堪萨斯分枝杆菌检测用引物和探针、使用该引物和/或探针的堪萨斯分枝杆菌的检测方法。使用本发明专利技术的堪萨斯分枝杆菌的检测方法，与现有的通过菌的培养检查等鉴定菌种的方法比较，可以极其迅速且高精度地进行堪萨斯分枝杆菌的检测。另外与现有的通过使用引物或/和探针的PCR法的诊断方法比较，有可能排除诊断上的假阳性，可以更高精度地进行堪萨斯分枝杆菌的检测和诊断。另外也可以进行堪萨斯分枝杆菌菌体的定量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用核酸扩增及其检测体系，在临床检查中检测和/或鉴定堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii,以下称为 M.kansasii)的方法。
技术介绍
非结核性抗酸菌(nontuberculous mycobacterium, NTM)是被分类在分枝杆菌(Mycobacterium)属的具有抗酸性性质的革兰氏阳性杆菌，是结核菌群和Mycobacterium,leprae以外的一种抗酸菌。在非结核性抗酸菌中，临床上引人注目的菌种已知有堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、戈氏分枝杆菌(Mycobacteriumgordonae)、斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、胺肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)等。特别是由堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌这2种菌引起的感染症占非结核性抗酸菌症全体的90%以上。通常，人们认为非结核性抗酸菌对健康人是无害的，但偶尔对人也表现出感染性，引起非结核性抗酸菌症。特别是对于象感染了 AIDS病毒那样的免疫功能缺陷者，成了重大的感染起因菌。虽然非结核性抗酸菌症一直是很稀少的疾病，但由于近年有增加倾向，所以期盼开发在短时间能够鉴别结核菌和非结核性抗酸菌的方法。加之鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的核酸扩增检测和诊断法适用于健康保险，在全国急速推广之后，其诊断上的意义很大。由于非结核性抗酸菌大多数对抗结核药表现出抗性，当患者存在抗酸菌感染症的嫌疑时，结核症还是非结核性抗酸菌症的鉴别诊断在决定治疗方针上很重要。另外由非结核性抗酸菌引起的疾病因其菌的种类不同，治疗法也各异，所以确定其菌种也非常重要。然而，由于非结核性抗酸菌症没有特异的临床症状，所以根据临床所见、病理组织学所见鉴别结核症和非结核性抗酸菌症，以及进一步确定非结核性抗酸菌的种类极其困难。因此，结核症还是非结核性抗酸菌症的诊断必须通过菌的鉴定进行。 作为一般的诊断法，首先进行喀痰涂抹检查。该检查仅判断所谓的“抗酸菌阳性”，不能鉴别是结核菌还是非结核性抗酸菌。因此在喀痰涂抹检查中为阳性时，通过在小川培养基等培养基上分离培养，进行菌的培养检查，鉴别是结核菌还是非结核性抗酸菌。然后再进行生物化学的试验，鉴定菌种。然而分枝杆菌属发育一般比较慢，培养需要相当长的时间。因此，当进行作为现在基本法的涂抹检查或培养检查时，为了获得是否是结核症的诊断结果，仅菌的分离培养就需要3 4周时间。而且还存在着为了鉴定菌种而进行的各种生物化学的试验还需要2 3周时间的问题。另外堪萨斯分枝杆菌的鉴定也要通过生物化学的试验进行。通过生物化学的试验鉴定堪萨斯分枝杆菌的主要鉴定方法是利用细菌暴露于光就生产色素的性质，但由于几个其它的分枝杆菌属的菌种也表现出与堪萨斯分枝杆菌同样的生物化学的特性，所以通常利用发色性鉴定堪萨斯分枝杆菌也存在问题。近年来，一直在开发于基因水平检测菌的技术。例如，研究了作为有用的手段利用聚合酶链反应(PCR)等核酸扩增技术的诊断技术。该方法具有灵敏度高，可以检测数个菌、时间短(最长4日)的优点。而且，运用通常的PCR法无论是活菌还是死菌都可同样检测。然而无论菌数多少都被判定为阳性，由于不知道菌数，有无感染性的诊断变得不确实。加之灵敏度过高，具有容易出现假阳性的判定等问题。就堪萨斯分枝杆菌来说，有从堪萨斯分枝杆菌的基因组文库获得DNA探针(pMKl-9)的研究(非专利文献I)。该DNA探针(pMKl-9)虽然可以与堪萨斯分枝杆菌的DNA形成互补的杂化体，但与其它种的分枝杆菌也同样可形成杂化体，所以对堪萨斯分枝杆菌不特异。在堪萨斯分枝杆菌的鉴定中还有着眼于使用pMKl-9探针和与堪萨斯分枝杆菌的rRNA基因特异杂交结合的市售的DNA探针(ACCUPROBE ，GenProbe, San Diego，加利福尼亚州)的研究(非专利文献2)。然而，在该研究中报告了 pMKl-9探针和市售的DNA探针(ACCU-PR0BETM)中的任一个都不能检测相当数量的堪萨斯分枝杆菌株种。另外，在堪萨斯分枝杆菌的检测中还有使用市售的DNA探针(ACXU-PR0BETM)进行评价的其它研究(非专利文献3)。这些研究者们的实验中，ACXU-PROBE 是100 %种特异的，对于其它的分枝杆菌种没有表现出交叉反应，但只可检测出堪萨斯分枝杆菌株中的73 %。 有报告称可以从堪萨斯分枝杆菌的临床分离体纯化堪萨斯分枝杆菌特异的DNA杂化体形成探针(P6123)(非专利文献4)。该探针(p6123)对实验中使用的所有堪萨斯分枝杆菌株都可形成杂化体，也包括对Ross等人的DNA探针(pMKl-9)没有反应的亚类。美国专利第5，500，341号(专利文献2)公开了由P6123探针纯化的堪萨斯分枝杆菌特异的增殖引物。另外，B.Boddinghaus等人报道了特异增殖的、与分枝杆菌DNA杂交结合的,从16S的rRNA纯化分离的分枝杆菌属特异的寡核苷酸(非专利文献5)。另外还进行了例如有关对堪萨斯分枝杆菌检测有效的DNA区域的鉴定的研究(例如专利文献I等)，但现状是还没有确立对堪萨斯分枝杆菌特异的诊断法。以上所述可知现状是希望确立新的特异检测非结核性抗酸菌的方法。专利文献I特开平11-155589号公报专利文献2美国专利第5，500,341号公报专利文献3特开昭60-281号公报非专利文献IZ.H.Huang 等人，J.Clin.Microbiol.，1991，29，p.212非专利文献2]B.C.Ross 等人，J.Clin.Microbiol.，1992，30，p.2930非专利文献3Tortoli 等人，Eur.J Clin.Microbiol.1nfect.Dis.，1994,13，p.2非专利文献4]M.Yang 等人，J.Clin.Microbiol.，1993，31，p.2769非专利文献5]B.Boddinghaus 等人，J.Clin.Microbiol.，1990，28，p.1非专利文献6]F.Poly 等人，J.Bacteriology, 2004,186，14，p.4781-479
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术是鉴于上述所述状况形成的专利技术，目的在于提供排除诊断上假阳性的新的堪萨斯分枝杆菌检测用引物、以及使用该引物的简便、迅速且精度高的堪萨斯分枝杆菌的检测方法。用于解决课题的手段本专利技术是以解决上述课题为目的形成的专利技术，构成以下。(1)含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列(其中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鸟嘌呤、T表示胸腺嘧啶。另外，任意位置的T可以被替换为尿嘧啶(U)。下同)的部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。(2)含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核本文档来自技高网...
【技术保护点】
由任一序列号2～4所示的核酸序列或其完全互补序列组成并且与堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：石川友一，
申请(专利权)人：和光纯药工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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