处理实验室耗材表面上存在的残留核酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种处理实验室耗材表面上存在的残留核酸的新方法。这种方法组合两个处理阶段：i)用气相环氧乙烷处理；然后ii)用液相或气相过氧化氢处理所述表面。这种处理的效果是避免所述残留核酸的扩增，特别是在PCR或TMA反应期间。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及ー种处理耗材表面上存在的残留核酸的方法，更具体地是实验室耗材，特别是用于扩增DNA或RNA样品的实验的管和滤器。更具体地，本专利技术的目的在于解决在实施使用聚合酶链反应(PCR)或转录介导的扩增(TMA)反应的技术时，由所述耗材表面上存在的残留核酸的特异性或非特异性扩增所引起的问题。这些残留核酸一般来自环境，可以游离形式存在，或者包含在活细胞如微生物、病毒或原生动物中。
技术介绍
核酸扩增反应由一系列酶促反应组成，包括使得能够从最初存在于反应介质中的核酸序列合成新核酸分子的聚合酶的作用。这些酶促反应的目的一般是产生最初少量存在于样品中的相同核酸序列的拷贝。最常使用的扩增是包括连续聚合或转录反应的那些扩增，如PCR和TMA。这类技术被广泛描述，并且是本领域技术人员公知的。使用特异性引物，它们使得能够在单个DNA或RNA模板的基础上将相同核酸序列复制非常高的次数。在这类反应中，用来起始聚合反应的引物的核苷酸序列决定扩增哪个核酸序列。通过扩增反应获得的核酸序列可用于分子生物学领域中的许多应用，如基因克隆、遗传性疾病的诊断或者病毒或微生物的检测[Vosberg, H.P.，(1989)The polymerasechain reaction:an improved method ior the analysis of nucleic acids, HumGenet.83 (I): 1-15]。根据进行酶促反应的条件，特别是所用的严格性的程度(盐的浓度和杂交温度)，可能扩增这样的DNA或RNA序列，其序列与试图扩增的序列或多或少相同。为了获得给定序列的非常特异性的扩增，即仅靶向具有与引入反应介质的引物的序列相同的序列的核酸，应当采用高严格性的条件。相反地，当试图扩增相对于所用的引物具有一定可变性的序列时，反应条件应当具有较低的严格性。在用于微生物检测、遗传研究或感染性疾病的诊断的通用测试的情况下，考虑到个体或物种之间序列的差异，常常必须寻找相对于所探寻的序列类型具有一定可变性的核酸序列。为此，通常必需求助于较低的严格性，使得能够考虑遗传多祥性。然而，在低严格性条件下进行的测试具有扩增来自研究样品外源性的残留核酸的序列的风险。“假阳性”的出现由此所致，其可以大大地扭曲测试結果。在微生物的通用检测的情况下，与来自环境的残留核酸的存在相关的假阳性的风险非常高[Schmidt, T., Hummel, S., Hermann, B., 1995, Evidence of contamination in PCRlaboratory disposables;Naturwissenschaften82]。在法医学中，当试图在 罪犯的遗传指纹的基础上确认其身份时，也有非零的风险，实验室中使用的管或设备可能被另ー个人的DNA污染，或者甚至被操作者的DNA污染。因此难以肯定地建立该罪犯的DNA谱。因为这些原因，扩增核酸专用的装置完全去除可扩增的残留核酸是非常重要的。一般来说，用于分子生物学反应的消耗性产品，包括DNA或RNA的扩增反应涉及的那些消耗性产品在进行常规灭菌的最終步骤之前在洁净室中制造以确保不存在微生物。然而，这些常规灭菌方法不足以消除来自耗材表面的所有可扩增的核酸。不含人DNA、RNA、DNA酶、RNA酶和其他PCR抑制剂的耗材可以接受“PCR清洁”标签。然而这并不表示它们不含来自环境的细菌核酸。可以使用诸如核酸内切酶的酶或诸如补骨脂素的化学产物以使得残留核酸分子不可扩增。然而，这类产品或酶可以与扩增反应中使用的试剂和样品不良地相互作用。去除残留的可扩增的核酸的其他方法使用电离辐射(紫外线(UV)、gammaU)、X-射线和beta(P))，但是为了更有效，暴露的持续时间必须为几个小时，这使得该过程非常昂贵，并且最重要的是，这降解或削弱制备耗材的材料。此外，电离辐射的操作受到严格管理，这限制其实施的可能性。目前，为了灭菌其耗材，申请人使用名为Sterrad (Johnson&Johnson)的商业化过氧化氢处理方法。过氧化氢是ー种氧化性气体，其使得能够通过氧化来破坏微生物的细胞组分，特别是蛋白，并且在较少程度上破坏核酸。Sterrad 方法使用低温下的气体形式的90%过氧化氢。根据这种方法,将真空相施用于室,待处理的耗材位于该室中，从而气相穿透并通过待处理的装置的所有部件内。在循环结束吋，再次施用真空阶段，而通过施用电场和等离子体的形成来使过氧化氢分子电离。Sterrad方法的优点之ー是可以将装置灭菌，同时所述装置预包装在塑料小袋中。所述小袋包含过氧化氢可渗透的非织造合成的表面(Tyvek )。然而，申请人发现这种方法并不完全破坏包含在装置内的残留核酸。因此，Sten’acf方法仅部分地满足申请人的需要。应当注意到申请人专业从事制造适用于微生物检测测试的包含滤膜的膜过滤装置。这些微生物检测测试通常在通过已无菌的所述装置过滤液体样品之后通过PCR扩增来进行。这些装置通常由复杂的装置组成，包含导管、罐和滤膜，这使得它们的处理更困难。申请人:已应用Sten’ad 方法几次以试图完全消除装置中存在的残留核酸。然而，扩增仍显示来自微生物的核酸未完全消除(图3B)。
技术实现思路
因此申请人进行 研究以改进前述方法，以开发处理那些装置中存在的残留核酸的方法，所述方法具有以下条件:(i)不损坏构成装置的材料，特别是膜和滤器(例如 聚丙烯、PES、PVDF)，以及(ii)没有抑制那些装置适用的核酸扩增反应的效果。许多次测试后，申请人已确定待处理的表面的两步去污处理允许满足上文提到的条件。所开发的方法包括通过气相环氧こ烷处理的第一歩，然后用液相或气相过氧化氢处理的第二歩。申请人发现这两步的组合使得能够比现有技术更完全去污。具体地，通过比较测试，申请人发现处理装置的两步的效果是消除任何不期望的扩增，甚至在残留核酸最初包含在微生物中时也是如此，这在仅进行处理步骤之ー时是不可以实现的。本专利技术的不同模式和由此所致的优点在下文中详述。附图说明图1:比较应用于最初包含在微生物(表皮葡萄球菌(S.epidermis))中的残留DNA的不同去污处理的图。接受各种处理之前将耗材(1.5ml管)的表面用相同数量的表皮葡萄球菌细胞污染。NS(浅灰色):未处理。EO(中灰色):通过气相环氧こ烷处理。ECHH2O2 (I)(黒色):根据本专利技术通过气相环氧こ烷然后通过液体溶液中的过氧化氢(30%)处理。Neg.(深灰色):未被表皮葡萄球菌污染的阴性对照。为了检测可能的来自表皮葡萄球菌的残留DNA，然后将这样处理的表面漂洗，并且对漂洗产物进行PCR反应(40个循环)。曲线代表通过荧光检测的扩增的DNA的量。图2:比较应用于最初包含在微生物(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))中的残留RNA的不同去污处理的图。在接受各种处理之一之前将耗材(1.5ml管)的表面用相同数量的铜绿假单胞菌细胞污染。2A:E0(中灰色):通过气相环氧こ烷处理。Y (深灰色):用Y辐射处理。NS(浅灰色):未处理。2B:E0+H202 (I)(黒色):用气相环氧こ烷然后用溶液中的过氧化氢(30%)处理。Y+H2O2(I)(深灰色):通过Y辐射然后用溶液中的过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.10.19 FR 10585161.种处理耗材的表面上存在的可扩增的残留核酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: i)用气相环氧こ烷处理所述耗材的表面；然后 ii)用液相或气相过氧化氢处理所述表面。2.利要求1的方法，其中步骤i)中的环氧こ烷以70%-90%(v/v)的浓度使用。3.利要求1或2的方法，其中步骤ii)中的过氧化氢为液相，其浓度为25%-60%，并且优选大于30%(v/v)。4.利要求3的 方法，其中将所述液相过氧化氢加热至50°C-70° C的温度，优选大于 60° C。5.利要求2或3的方法，其中在步骤ii)中使所述液相过氧化氢与待去污的表面接触至少40分钟的时间。6.利要求1的方法，其中用过氧化氢处理是在气相中进行。7.利要求6的方法,其中将所述过氧化氢蒸发,使其浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·普雷塞尔，D·梅茨，
申请(专利权)人：EMD密理博公司，
类型：
国别省市：