一种抗AChE干扰且能快速检测BChE活性的方法，步骤如下：1）以磺化杯[4]芳烃和染料光泽精作为酶活性检测的传感对，以琥珀酰胆碱作为酶反应底物，37°C下用10mmol/L?pH8.0的磷酸缓冲溶液配置含有0.5μmol/LSC4A、0.5μmol/L?LCG和10μmol/L?SuCh的溶液，建立超分子串联检测体系；2）在上述体系中加入1U/ml的BChE，即可在15min内得到明显的荧光淬灭信号。本发明专利技术的优点是：该方法工艺简单、便于操作、灵敏快速、能够在过量的AChE存在下，高选择的检测BChE的活性，在专一检测BChE活性和阿尔兹海默症的治疗领域具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
—种抗AChE干扰且能快速检测BChE活性的方法
本专利技术属于酶活性检测技术，特别是一种抗AChE (乙酰胆碱酯酶)干扰且能快速检测BChE (丁酰胆碱酯酶)活性的方法。
技术介绍
近年来，由于胆碱酯酶在人体内神经递质传感中的重要性，以及在阿尔兹海默症治疗中的关键作用受到广泛关注，参见:Lane, R.M.;Potkin, S.G.;Enz,A.1nt.J.Neuropsychopharmacol.2006, 9, 101 - 124。目前，基于胆碱酯酶活性的检测和相应的抑制剂的筛选已经成为研究热点，参见:l)Pardo_Yissar，V.;Katz, E.;Wasserman, J.;ffiI lner, 1.J.Am.Chem.Soc.2003，125，622-623 ;2) Maeda, H.; Mastuno, H.; Ushida, M.; Katayama, K.; Saeki, K.; Itoh, N.Angew.Chem., Int.Ed.2005, 44, 2922 - 2925 ；3) Bailey,D.M.; Hennig, A.; Uzunova, V.D.; Nau, ff.M.Chem.Eur.J.2008, 14, 6069 - 6077 ；4) Nau, ff.M.;Ghale, G.;Hennig, A.;Bakirci, H.;Bailey, D.M.J.Am.Chem.Soc.2009, 131, 11558 - 11570 ；5) Ghale, G.; Ramalingam, V.; Urbach, A.R.; Nau, ff.M.J.Am.Chem.Soc.2011, 133, 7528 -7535 ；6) Dsouza, R.N.; Hennig, A.; Nau, ff.M.Chem.Eur.J.2012, 18, 3444 - 3459。脊柱动物体内普遍存在两种重要胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE),相似度 >65%,参见:Massoulie, J.; Sussman, J.; Bon, S.; SiIman, 1.BrainRes.1993，98，139146。研究证明，BChE在人体内具有清除体内抗胆碱物质，将药物前体转化为活性组分等重要的作用，参见:Cokugras1A.N.Turk.J.Biochem.2003，28，54 - 61。并且，在阿尔兹海默症患者的体内，AChE的活性降低，BChE活性升高，使得BChE可以作为该疾病诊断和治疗的目标，参见:Lane, R.Μ.; Potkin, S.G.; Enz, A.1nt.J.Neuropsychopharmaco1.2006，9，101 - 124。但是，现有的多数检测胆碱酯酶活性的方法都是针对AChE活性的检测，目前还没有一种能够快速直接 选择性检测BChE的方法。所以，建立一种抗AChE干扰，并且能够灵敏、快速、实时、专一检测BChE活性的方法具有重大的意义和广阔的应用前景。超分子串联检测是一种新颖的酶活性测定方法，主要利用大环主体化合物与荧光染料、酶底物、相应产物三者键合强弱的差异得到荧光检测信号，再应用到酶反应过程中，达到通过检测荧光信号检测酶活性的目的，参见:Dsouza，R.N.; Hennig, A.;Nau, ff.M.Chem.Eur.J.2012，18，3444 - 3459。同时，荧光光谱检测技术具有经济、易于操作、直观且快速得到响应信号等优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术分析，提供一种抗AChE (乙酰胆碱酯酶)干扰且能快速检测BChE (丁酰胆碱酯酶)活性的方法，该检测方法工艺简单、便于操作、无需标记、灵敏快速、直观持续、具有良好的生物相容性，能够在过量的AChE存在下，高选择的检测BChE的活性，即时快速的给出明显的荧光检测信号。本专利技术的技术方案:一种抗AChE (乙酰胆碱酯酶)干扰且能快速检测BChE (丁酰胆碱酯酶)活性的方法，以磺化杯[4]芳烃(SC4A)和染料光泽精(LCG)作为酶活性检测的传感对，以琥珀酰胆碱(SuCh)作为酶反应底物，建立了用于BChE活性监测的超分子串联检测体系，步骤如下:I)在37° C温度下，用10mmol/L pH8.0的磷酸缓冲溶液配置含有0.5μπιο1/LSC4A、0.5 μ mol/L LCG和10 μ mol/L SuCh的溶液，得到用于BChE活性监测的超分子串联检测体系；2)在上述体系中加入lU/ml的BChE，即可在15min内得到明显的荧光淬灭信号。本专利技术的工作原理: 选择SC4A和LCG作为检测过程的传感对。SC4A与酶催化反应的底物(SuCh)及相应产物(Ch)键合差异明显，且和LCG、SuCh, Ch均有较大的键合常数。同时SC4A具有很好的生物相容性，经济易得；光泽精作为竞争染料，量子产率高且和磺化杯[4]芳烃作用后荧光淬灭显著，与底物/产物竞争键合的过程中显示出明显的荧光强度变化，得到响应信号。以神经肌肉的弛缓药物琥珀酰胆碱(SuCh)作为酶反应的底物，它能够专一的被BChE水解，而不被AChE水解，且酶反应后生成的Ch与SC4A键合更弱，体系荧光淬灭得到检测信号，这是实现选择性检测BChE活性的前提。本专利技术的优点是:该方法工艺简单、便于操作、无需标记、灵敏快速、直观持续、具有良好的生物相容性，能够在过量的AChE存在下，高选择的检测BChE的活性，即时快速的给出明显的荧光检测信号，在专一检测BChE活性和阿尔兹海默症的治疗领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为SuCh和C h分别与SC4A.LCG传感对的竞争键合荧光滴定结果拟合图。图2为超分子串联检测体系分别检测AChE和BChE活性的荧光响应对比图。图3为超分子串联检测体系在AChEO-7倍过量时对lU/ml BChE活性检测的影响。图4为超分子串联检测体系中，分别加入0_300nmol/L他克林对BChE活性抑制的荧光响应。图5为由加入不同浓度的他克林得到的反应初速度拟合得他克林的IC5tl值。具体实施方式实施例:一种抗AChE (乙酰胆碱酯酶)干扰且能快速检测BChE (丁酰胆碱酯酶)活性的方法，以磺化杯[4]芳烃(SC4A)和染料光泽精(LCG)作为酶活性检测的传感对，以琥珀酰胆碱(SuCh)作为酶反应底物，建立了用于BChE活性监测的超分子串联检测体系，步骤如下:I)在37° C温度下，用10mmol/L pH8.0的磷酸缓冲溶液配置含有0.5μπιο1/LSC4A、0.5 μ mol/L LCG和10 μ mol/L SuCh的溶液，得到用于BChE活性监测的超分子串联检测体系；所述10mmol/L pH8.0磷酸缓冲溶液的配置方法是:称取1.56g磷酸二氢钠和0.33g氢氧化钠配置成lLlOmmol/L pH8.0磷酸缓冲溶液；选择SC4A和LCG作为检测过程的传感对，采用竞争键合荧光滴定方法测得了 SC4A和LCG、SuCh, Ch均有较大的键合常数(Ks为IO5-1O6),提高了体系的灵敏度，且SC4A与酶催化反应的底物(SuCh)及相应产物(Ch)键合大小相差一个数量级，竞争键本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗AChE（乙酰胆碱酯酶）干扰且能快速检测BChE（丁酰胆碱酯酶）活性的方法，其特征在于：以磺化杯[4]芳烃（SC4A）和染料光泽精(LCG)作为酶活性检测的传感对，以琥珀酰胆碱(SuCh)作为酶反应底物，建立了用于BChE活性监测的超分子串联检测体系，步骤如下：1）在37°C温度下，用10mmol/L?pH8.0的磷酸缓冲溶液配置含有0.5μmol/LSC4A、0.5μmol/L?LCG和10μmol/L?SuCh的溶液，得到用于BChE活性监测的超分子串联检测体系；2）在上述体系中加入1U/ml的BChE，即可在15min内得到明显的荧光淬灭信号。
【技术特征摘要】
1.一种抗AChE (乙酰胆碱酯酶)干扰且能快速检测BChE (丁酰胆碱酯酶)活性的方法，其特征在于:以磺化杯[4]芳烃(SC4A)和染料光泽精(LCG)作为酶活性检测的传感对，以琥珀酰胆碱(SuCh)作为酶反应底物，建立了用于BChE活性监测的超分子串联检测体系，步骤如下: 1)在37°C...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘育，郭东升，杨婧，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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