本发明专利技术涉及一种检测具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的方法，该方法包括如下步骤：(1)提取样品微生物的DNA；(2)分别采用序列表中SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示引物对1、SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示引物对2，及SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6所示引物对3对样品微生物的DNA进行PCR扩增；(3)将PCR扩增产物连接转化至感受态细胞并测序；(4)分析序列，得到样品中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的信息。本发明专利技术用特异性引物扩增样品中的微生物DNA，结合测序的方法获得样品中具有厌氧条件下烃降解功能的微生物的信息。本发明专利技术的检测特异性强，操作便捷，检测准确、全面，克服了依赖培养及计数的传统检测方法所存在的各种缺陷。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测鉴定
，尤其是涉及一种检测具有厌氧条件下降解烃功能微生物的方法。
技术介绍
油藏是一个典 型的厌氧环境，其中蕴含大量的石油烃并孕育功能多样的微生物。在这个巨大的地质生物反应器中，普遍存在可在厌氧条件下降解烃类的微生物。原油两大组份是由芳香烃、烷烃和浙青质组成，多数烃类溶解性差，化学性质较为稳定不易降解。芳香烃中，苯、甲苯、乙苯、二甲苯(BTEX化合物)是强污染物，因而备受关注。但是，烷烃中也有一些是有毒的，所以研究厌氧降解烷烃的微生物同样具有重要意义。研究表明，具有厌氧降解烷烃功能的微生物主要有硝酸盐还原菌、硫酸盐还原菌及产甲烷菌群。厌氧条件下微生物降解烃有利于提高原油采收率，是目前国内外研究的热点。这项研究在油藏残余油生物气化开采和石油污染生物修复方面具有重大的理论意义和应用价值。在分析检测烃降解微生物方面，传统技术主要包括以下3种方法:(1)液体筛选培养方法一采用以烃为唯一碳源的选择性培养基培养待检测样品，经反复培养，优胜劣汰，最后获得能够降解烃的微生物，然后用镜检法和比浊法测定培养物中的菌量；(2)固体培养方法一用含有烃、氮和磷等营养物质的固体培养基筛选分离烃降解菌，同时可以结合平板菌落计数法和最大概率数法(MPN法)测菌数。(3)细菌瓶法一与MPN法的基本原理和方法相同，利用烃降解产物的反应现象指示微生物生长。上述3种方法中，细菌瓶法目前应用较多，但是这3种方法都如下缺陷:检测不全面，较适合于好氧菌检测、而用于厌氧菌检测时难度非常大；对于丰度低的微生物，可能因为培养条件不适逐渐被淘汰而造成漏检；检测周期长、消耗大，对于生理特性不同的微生物必须分别采用不同培养条件检测，因而工作量大；检测镜检法、比浊度法、MPN和细菌瓶法均不能得到烃降解菌的分类信息。此外，环境样品中(如油藏)发育着丰富多样的微生物，绝大多数具有降解烃功能，但其中多数微生物属于不可培养的，由于传统方法依赖于培养，因此采用传统方法无法认知这些微生物，导致了这类微生物的群落结构与功能认识上的一个盲区。本专利技术用特异性引物扩增样品中的微生物DNA，结合测序的方法获得样品中具有烃降解功能的微生物的信息。本专利技术的检测特异性强，操作便捷，检测准确、全面，克服了依赖培养及计数的传统检测方法所存在的各种缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种针对性强、操作简便、检测全面准确的快速检测样品中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现。本专利技术提供，该方法包括如下步骤:(I)提取样品微生物的DNA ；(2)分别采用序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对1、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示引物对2，及SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6所示引物对3对样品微生物的DNA进行PCR扩增:(3)将PCR扩增产物连接转化至感受态细胞并测序；(4)分析序列，得到样品中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的信息。本专利技术的方法中，步骤(2)采用的引物对具体为:引物对I正向:CCNACCACNAAGCAYGG(SEQ ID N0:1),反向:TCGTCRTTGCCCCATTTIGGIGC(SEQ ID N0:2)；引物对2正向:TCGAYGAYGGSTGCATGGA(SEQ ID NO:3)，反向:TTCTGGTTYTTCTGCAC(SEQ ID N0:4)；引物对3正向:GCAGTACAAYTCCTACACSACYGABATGGT(SEQ ID NO:5)，反向:CCRTGCTTSGGRCCVGCCTGVCCGAA(SEQ ID NO:6)。分别采用上述各引物对对样品微生物的DNA进行PCR扩增的反应体系组成为无菌7jC 12 μ L,2XTaq PCR master mix9yL、浓度为12.5 μ mol.Γ1的引物对的正向和反向引物各I μ L、样品微生物的DNA2 μ L。所述样品微生物的DNA浓度调整在50ng.μ L—1左右。采用上述引物对对样品微生物的DNA进行PCR扩增的反应程序为:a)94° C保温5min ；b)94° C 保温 45s;c)60° C 保温 Imin ;d) 72 ° C 保温 Imin ;e)重复执行 b) d) 48次；f)72° C保温IOmin后结束。附图的简要i兑明附图说明图1是PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。这些实施例只是用于说明本专利技术，并不构成对本专利技术范围的限制。实施例华北某油田采油井产出液样品(S1、S2、S3、S4)中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的检测1.提取样品中微生物的DNA采用Axygen细菌基因组DNA提取试剂盒(Axygen Biosciences, Inc.,美国)，按照说明书描述的方法提取华北油田采油井产出液样品微生物的DNA。 2.分别采用引物对I (正向:CCNACCACNAAGCAYGG，反向:TCGTCRTTGCCCCATTTIGGIGC),引物对 2 (正向:TCGAYGAYGGSTGCATGGA，反向:TTCTGGTTYTTCTGCAC)及引物对 3 (正向:GCAGTACAAYTCCTACACSACYGABATGGT，反向:CCRTGCTTSGGRCCVGCCTGVCCGAA)对样品微生物的 DNA 进行 PCR 扩增。I) PCR扩增反应体系利用引物对1、引物对2和引物对3对样品微生物DNA分别进行PCR扩增，PCR扩增反应体系组成相同，包括12 μ L无菌水，9 μ L2XTaq PCRmaster mix和浓度为12.5 μ mo I.Γ1的引物对的正反向引物各I μ L，最后加入提取的样品中微生物的DNA2 μ L。2 ) PCR扩增反应程序利用引物对1、引物对2和引物对3进行样品微生物DNA扩增的PCR反应程序相同:a) 94° C 保温 5min ;b)94° C 保温 45s;c)60° C 保温 Imin ;d) 72° C 保温 lmin;e)重复执行b) d) 48次；f) 72° C保温IOmin后结束。3) PCR扩增反应结束后，取5μ L PCR产物，用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定、拍照。结果见图1。3.扩增产物连接转化至感受态细胞并测序采用Axygen胶回收纯化试剂盒(Axygen Biosciences, Inc.,美国),按说明书描述的方法提取扩增所得目的基因。采用Takara公司的pMm^-T Simple载体试剂盒，按说明书描述的方法将提取得到的目的基因连接转化至大肠杆菌感受态细胞中，培养连接转化后的细胞，然后将培养所得细胞送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。I)引物对I扩增SI样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞后测序，代表序列 All (SEQ ID NO:7):TCGGCCACGGCCAACTGCGCCAAGATGGTGGAATACGCTCTTCTAAACGGCTACGACCCGGTTGTTCAGATGCAGATGGGGCCAAAGACCGGCGATTCCGCCAAGTTCACGGACTTCGAGCAGCTTTTCGCCG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取样品微生物的DNA；(2)分别采用序列表中SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示引物对1、SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示引物对2，及SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6所示引物对3对样品微生物的DNA进行PCR扩增；(3)将PCR扩增产物连接转化至感受态细胞并测序；(4)分析序列，得到样品中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的信息。
【技术特征摘要】
1.一种检测具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)提取样品微生物的DNA; (2)分别采用序列表中SEQID N0:1和SEQ ID NO:2所示引物对1、SEQ ID N0:3和SEQID N0:4所示引物对2，及SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6所示引物对3对样品微生物的DNA进行PCR扩增； (3)将PCR扩增产物连接转化至感受态细胞并测序； (4)分析序列，得到样品中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的信息。2.根据权利要求1所述的检测具有厌氧条件下降解烃功...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟伯中，刘金峰，杨世忠，王立影，管婧，杜云浩，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。