一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法。所述方法包括：将蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液除去蛋白多糖；除去多糖后收集沉淀，用乙酸溶液溶解沉淀；溶液采用胃蛋白酶酶解释放Ⅱ型胶原蛋白；酶解液离心后取上清进行盐析充分沉淀Ⅱ型胶原蛋白；离心收集沉淀Ⅱ型胶原蛋白离心并用乙酸再次溶解，溶解液透析除胃蛋白酶和其他杂蛋白；透析袋中Ⅱ型胶原蛋白再次使用乙酸溶解并透析除去盐离子；将透析后的袋内液体低温冷冻真空干燥，得到蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术方法操作简单，制得Ⅱ型胶原蛋白纯度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种以蕲蛇为原料提取II型胶原蛋白的方法。
技术介绍
II型胶原(collagen type II, C II )是软骨基质的主要有机成分,是关节软骨中主要细胞外间质之一。近年来研究表明，类风湿性关节炎的发病与C II自身免疫反应有关[Deyl Z, Miksik I, Eckhardt A.Preparative procedures and purity assessment ofcollagen proteins [J].Chromatography B, 2003, 79(12): 245-275.Smolen JS, HayerS, Schett G, et al.Tmmunosenescence autoimmunity and Rheumatoid Arthritis[J].Autoimmunity and rheumatoid arthritis, 2004, 31 (1): 23-25.],用 C II 免疫某些动物可诱导出实验性关节炎[Sweeney SE, Firestein GS.Rheumatoid arthritis:regulation of synovial inflammation [J].1ntern J Biochemical Cell Bio, 2004,36(3): 372-378.]，口服C II诱导免疫耐受对类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)有显著的疗效[卢延旭，陈敏珠.可溶性鸡II型胶原对关节炎大鼠的免疫治疗作用[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9 (2): 180-183.]。因此，C II的提取纯化与鉴定的研究具有较大的价值，获得纯化的C II是进行相关研究的关键。虽然C II在人体含量较多，但临床取材可获得的数量有限；C II与蛋白多糖形成紧密的结合，难以用单纯的化学方法提取。目前所报道的方法，操作复杂，条件不一，结果存在差别。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种以蕲蛇为原料提取II型胶原蛋白的方法。本专利技术采用的技术 方案是:一种以蕲蛇为原料提取II型胶原蛋白的方法，所述方法包括:(I)蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4 6°C搅拌24 30h，离心，去上清，沉淀用4(T60 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4 5M，Tris-HCl浓度为40 60 mM ；(2)步骤(I)所得沉淀用0.5^1 M乙酸水溶液重悬，以6(Γ80%甲酸水溶液调节pH值为2 3，加入足量胃蛋白酶，4 6°C搅拌48飞0h，离心，弃去沉淀；(3)步骤(2)得到上清液滴加5 6M NaCl溶液至NaCl浓度为0.8 0.9 M，4 6°C静置12 24h，离心，去除上清液；(4)步骤(3)得到沉淀用足量0.05、.2 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用2(T30 mM Na2HPO4充分透析，所得沉淀再用足量0.05、.2M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.05、.2M乙酸溶液充分透析，所得液体真空干燥，得到所述II型胶原蛋白的粉末。蕲蛇为蜂科动物五步蛇Agkistrodon acutus (Giienther)的干燥体。性味甘、咸，温；有毒。归经归肝经。功能主治祛风，通络，止痉。用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼歪斜，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风疥癣。临床发现，蕲蛇是临床治疗风湿痹证的要药，对RA有明显的治疗作用[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部[M],北京:中国医药科技出版社，2010:349.]，实验研究表明蕲蛇及II型胶原蛋白对RA都具有一定的治疗作用[Kyung-Su Park, Min-Jung Park, M1-La Cho, et al.Type IIcollagen oral tolerance; mechanism and role in collagen-1nduced arthritis andrheumatoid arthritis [J].Modern Rheumatology, 2009，6 (19): 581-589.]。本专利技术选择蕲蛇为原料，用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析和透析处理等步骤，制备出高纯度(纯度96.93%)的II型胶原蛋白，采用SDS-PAGE、紫外全波长扫描、HPLC和质谱对其进行了纯度分析和鉴定。所述蕲蛇粉末粒径不大于2_。步骤(2 )中胃蛋白酶加入量为300 800 U/g蕲蛇粉末。步骤(I)中所述蕲蛇粉末与盐酸胍-Tris-HCl混合溶液用量之比为IOOg:1000 5000mL。步骤(2)中步骤(I)所得沉淀与乙酸水溶液用量之比为100g:100(T3000mL。具体的，所述方法如下:(I)蕲蛇粉碎至粒径为2mm，粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4°C搅拌24h，4°C、14000Xg离心lh，去上清，沉淀用50 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4M，Tris-HCl浓度为50 mM, pH7.5 ；(2)步骤(I)所得沉淀用0.5 M乙酸水溶液重悬，以70%甲酸水溶液调节pH值为2.8，加入胃蛋白酶，4°〇搅拌4811，41:、1400(^8离心111，弃去沉淀；所述胃蛋白酶加入量为300^800 U/g蕲蛇粉末； (3)步骤(2)得到上清液滴加5M NaCl溶液至NaCl浓度为0.8 0.9 M，46°C静置12h，4°C、14000Xg离心lh，去除上清液；(4)步骤(3)得到沉淀用0.1 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20 mM Na2HPO4于4°C下充分透析，所得沉淀再用0.1M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.1M乙酸溶液于4°C下充分透析，所得液体真空干燥，得到所述II型胶原蛋白的粉末。本专利技术的有益效果主要体现在:本专利技术方法操作简单，制得II型胶原蛋白纯度高。附图说明图1为本专利技术方法流程图；图2为靳蛇II型父原蛋白成品照片；图3为II型胶原蛋白质SDS-PAGE电泳图；图4为蕲蛇II型胶原蛋白HPLC分析图；图5为蕲蛇与牛II型胶原蛋白质紫外全波长扫波图谱；图6为蕲蛇与牛II型胶原蛋白质谱图；上图为蕲蛇II型胶原蛋白，下图为牛II型胶原蛋白。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此:实施例1:方法如下:1、将蕲蛇(购自黄山市蛇类科学研究所)粉碎成粒径2 mm的粉末；2、将150克蕲蛇粉末置于2000 mL的4 M盐酸胍-50 mM的Tris-HCl混合溶液(pH7.5)中混悬，温度控制在4°C，搅拌24 h ；4°C, 14000Xg离心I h，去上清液，沉淀用50mM的Tris-HCl溶液洗去盐酸胍，4°C，14000 X g离心I h，去上清液；3、上步得到的沉淀用20倍沉淀体积的0.5 M乙酸重悬，并用70%的甲酸调节pH至2.8，向混悬液中加入5g胃蛋白酶(购自无锡中天食品添加剂有限公司，单位酶活15000U/g)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法，所述方法包括：（1）蕲蛇粉末用盐酸胍?Tris?HCl混合溶液混悬，4~6℃搅拌24~30h，离心，去上清，沉淀用40~60?mM?Tris?HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍?Tris?HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4~5M，Tris?HCl浓度为40~60?mM；（2）步骤（1）所得沉淀用0.5~1?M乙酸水溶液重悬，以60~80%甲酸水溶液调节pH值为2~3，加入足量胃蛋白酶，4~6℃搅拌48~60h，离心，弃去沉淀；（3）步骤（2）得到上清液滴加5~6M?NaCl溶液至NaCl浓度为0.8~0.9?M，4~6℃静置12~24h，离心，去除上清液；（4）步骤（3）得到沉淀用足量0.05~0.2?M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20~30?mM?Na2HPO4充分透析，所得沉淀再用足量0.05~0.2M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.05~0.2M乙酸溶液充分透析，所得液体真空干燥，得到所述Ⅱ型胶原蛋白的粉末。

【技术特征摘要】
1.一种以蕲蛇为原料提取II型胶原蛋白的方法，所述方法包括: (1)蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4 6°C搅拌24 30h，离心，去上清，沉淀用40-60 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4 5M，Tris-HCl浓度为40 60 mM ； (2)步骤(I)所得沉淀用0.5^1 M乙酸水溶液重悬，以60-80%甲酸水溶液调节pH值为2 3，加入足量胃蛋白酶，4 6°C搅拌48-60h，离心，弃去沉淀； (3)步骤(2)得到上清液滴加5 6MNaCl溶液至NaCl浓度为0.8 0.9 M，4 6°C静置12 24h，离心，去除上清液； (4)步骤(3)得到沉淀用足量0.05、.2 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20-30 mM Na2HPO4充分透析，所得沉淀再用足量0.05-0.2M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.05-0.2M乙酸溶液充分透析，所得液体真空干燥，得到所述II型胶原蛋白的粉末。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述蕲蛇粉末粒径不大于2mm。3.按权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中胃蛋白酶加入量为300-800U/g蕲蛇粉末。4.按权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述蕲蛇粉末与盐酸胍-Tris-HCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁兴红，谷恒存，丁志山，蒋福升，范永升，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：