本发明专利技术公开了一种氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶在催化合成N-乙酰甘露糖胺中的应用。即以氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶为催化剂，以N-乙酰葡萄糖胺为底物，制备N-乙酰甘露糖胺。本发明专利技术首次将氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶应用于N-乙酰甘露糖胺制备中，取得很好的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶(N-acety lglucosamine 2-epimerase, AGE)的应用，尤其涉及一种来自海藻Prochlorococcus marinus str.MIT9215 中的 N-乙酸葡萄糖胺异构酶(PmAGE)在以N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)为底物生产N-乙酰甘露糖胺(N-acety 1-D-mannosamine, ManNAc)中的应用。
技术介绍
N-乙酸甘露糖胺(N-acetyl-D-mannosamine，ManNAc)是一种重要的中间体，可用于抗流感药物前体及婴幼儿奶粉添加剂N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminicacid, Neu5Ac)的合成。以N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)为底物用于合成 ManNAc,再以ManNAc和丙酮酸为底物经N-乙酰神经氨酸缩合酶(N-acetylneuraminic acidlyase, Nal)催化合成N-乙酰神经氨酸是目前最主要的合成Neu5Ac的途径。而把廉价的底物GlcNAc经异构反应生成其昂贵的同分异构体ManNAc是两步反应中的关键步骤。 迄今为止关于催化GIcNAc合成ManNAc的反应已有许多报道。概括起来主要有化学法和生物催化法。化学催化法是在强碱性的条件下将GlcNAc异构成ManNAc，但是该方法对下游的底物及酶具有强烈的降解作用，因而不适合大规模应用[I]。生物催化法采用AGE在温和的条件下催化GlaNAc生成ManNAc，因而避免了化学法中强碱对下游反应的抑制作用。但是AGE只存在在自然界极少的几个物种中。目前报道的AGE主要集中在哺乳动物，如猪[2]、人[3]、老鼠[4];以及淡水藻，如Synechocystissp.PCC6803 [5]和 Anabaena sp.CHl [6]中；以及卵形拟杆菌 Bacteroides ovatusATCC8483[7]中。这些AGE的共同的特点是需要ATP作为激活剂。全细胞催化法可以克服反应体系中添加ATP的需要[8]，但其缺陷是细胞膜降低了底物的传质造成反应速率降低，而且全细胞催化剂无法长期稳定地重复利用。与此相反，通过酶的固定化方式进行ManNAc生产可以克服底物的传质作用而且酶可以长期重复利用，但是却需要添加高成本的ATP[9]。本专利中研究的AGE可以在不需要添加ATP的情况下表现出很高的酶活，从而很好地解决了酶催化法合成ManNAc中的瓶颈。本专利中涉及到的N-乙酰葡萄糖胺异构酶(PmAGE)是AGE的一种，其包含384个氨基酸，其在 Genbank 中的收录号为 YP_001484631.1, (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/protein/YP_001484631.1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码该蛋白的基因含有1155bp 喊基，其在 Genbank 中的收录号为 NC_009840.1, (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/NC_009840.1 report=genbank&from=1224454&to=l225608),其基因序列如 SEQID NO:1所示。至今未发现PmAGE用于ManNAc合成的报道。参考文献:[l]Blayer Sj Woodley JMj Dawson MJj Lilly MD(1999)Alkaline biocatalysisfor the direct synthesis of N-acetyl-D-neuraminic acid(Neu5Ac)fromN-acetyl-D-glucosamine(GlcNAc).Biotechnol Bioeng66:131-136。[2] Itoh T，Mikami Bj Maru I，Ohta Y，Hashimoto Wj Murata K (2000) Crystalstructure of N-acyl-D-glucosamine2_epimerase from porcine kidney at2.0Aresolution.J Mol Biol 303:733-44。[3] Lee JOj Yi JK.，Lee SG，Takahashi S，Kim BG (2004) Production ofN-acetylneuraminic acid from N-acetylglucosamine and pyruvate using recombinanthuman renin binding protein and sialic acid aldolase in one pot.Enzyme MicrobTechnol35:121_125。[4]Van Rinsum Jj Van Dijk Wj Hooghwinkel GJj Ferwerda W(1983)Subcellularlocalization and tissue distribution of sialic acid precursor-forming enzymes.Biochem J210:21_8。 [5] Tabata Kj Koizumi S，Endo T，Ozaki A ( 2002) Productionof N-acetyl-neuraminic acid by coup ling bacteria expressingN-acetyl-glucosamine2-epimerase and N-acetyl-neuraminic acid synthetase.EnzymeMicrob Technol30:327_333。[6] Lee YCj Chienj HCj Hsuj W.H.2007.Production of N-acetyl-D-neuraminicacid by recombinant whole cells expressing Anabaena sp.CHlN—acetyl—D-glucosamine2_epimerase and Escherichia coli N-acetyl-D-neuraminic acid lyase.JBiotechnoll29:453_60。[7]Sola-Carvajal A，Sanchez-Carron G，Garcia-Garcia MI，Garcia-CarmonaFj Sanchez-Ferrer A(2011)Properties of BoAGE2，a second N-Acetyl-D-glucosamine2-epimerase from Bacteroides ovatus ATCC8483.Biochimie94:222_230。[8] Tao F，Zhang Y，Ma C，Xu P (2011) One-pot bio-synthesis:N-Acety1-D~neuraminic acid production by a powerfu本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的N?乙酰葡萄糖胺异构酶在催化N?乙酰葡萄糖胺合成N?乙酰甘露糖胺中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶在催化N-乙酰葡萄糖胺合成N-乙酰甘露糖胺中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以氨基酸序列如SEQID N0:2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶为催化剂，以N-乙酰葡萄糖胺为底物，不需要ATP作为辅因子，制备N-乙酰甘露糖胺。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，表达基因序列如SEQID NO:1所示的重组菌，经过破碎与镍柱纯化后，将纯酶与N-乙酰葡萄糖胺在缓冲液中反应得到N-乙酰甘露糖胺。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，基因序列如SEQID NO:1所示的重组菌的构建方法如下:以Prochlorococcus marinus str.MIT9215基因组为模板扩增出N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因并连接到pET-28a载体上，再将重组质粒转化入E.coliRosetta (DE3)中。5....
【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，季雯燕，谢婧婧，孙梧进，陈勇，陈晓春，吴菁岚，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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