本发明专利技术涉及优化的基于酵母表达系统的重组人SPINK6(rhSPINK6)的DNA序列及其制备。具体地，本发明专利技术提出了优化的、适合酵母表达系统的rhSPINK6的DNA序列，高效生产rhSPINK6的方法，以及有关的工程菌的构建、rhSPINK6的表达优化、纯化的工艺和生物活性的研究。与大肠杆菌表达的rhSPINK6相比，本发明专利技术中酵母表达的rhSPINK6的生物活性提高了近3倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用重组DNA技术生产蛋白质领域。更具体的，本专利技术涉及基于酵母菌密码子偏爱设计优化的重组人SPINK6 (rhSPINK6)的DNA序列，以及酵母菌外分泌表达生产高生物活性rhSPINK6的方法。
技术介绍
生物体中，蛋白酶在生物学过程扮演非常重要的角色。除了降解食物外，蛋白酶的功能还包括纤溶、凝血、炎症、受精、发育等。丝氨酸蛋白酶是ー类蛋白水解酶，因其活性中心含有一个丝氨酸位点而得名；丝氨酸蛋白酶分布广泛，在人类中，大约有150多个编码丝氨酸蛋白酶的基因，其中许多是属于类胰蛋白酶家族。类胰蛋白酶家族含有胰蛋白酶、膜凝乳蛋白酶、凝血酶、血管舒缓素、顶体蛋白等。生物体中蛋白酶的功效是巨大的，但是其功能失控也会带来致命的影响。许多蛋白酶的功能受其抑制剂的紧密调控以不至于蛋白酶功能的失控；蛋白酶抑制剂是多肽或者蛋白，它作为蛋白酶的假性底物与反应部位紧密结合来抑制和调控蛋白酶的功能，能与体内參与各种调控作用的蛋白酶形成一定的动态平衡，调节生物体内的生命过程。到目前为止，有16000个蛋白酶抑制剂的序列被发现，并被分成67个家族，分别是丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或者金属蛋白酶抑制剤。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂属于蛋白酶抑制剂家族II，存在于鸟蛋、昆虫、虫下、哺乳动物组织和体液，与血凝、纤维蛋白溶解、胚胎发生、个体发育、食物消化、炎症和免疫应答等有着密切的关联。目前已经发现100多种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂；人类基因组中，经典的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂主要有spinkl、spink2、spink4、spink5、spink6、spink7、spink8、spink9、spinkl3等。经典的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构非常保守，特征是至少含有ー个长度为40 60个氨基酸的Kazal结构域,含6个半胱氨酸形成的3对ニ硫键，活性位点在P1位(第二个半胱氨酸后的第二个氨基酸残基)，许多抑制剂常含有一段信号肽，位于N末端,其长度大约为20个氨基酸。不同的Pl残基能抑制同一种丝氨酸蛋白酶，而同一 Pl残基能抑制多种丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶活性部位“ ロ袋”大小和Pl残基侧链结构、极性、离子电荷等因素均影响酶-抑制剂的相互作用，当Pl残基为Lys、Arg时,对胰蛋白酶和类胰蛋白酶有显著的抑制作用，而Pl残基为Pro、Tyr> Phe> Leu、Met时，能抑制胰凝乳蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶，Pl残基为Ala、Ser时，能抑制弾性蛋白酶。因此Pl残基的突变能显著地改变抑制剂的专一性和结合能力。对SPINK6的研究结果显示，SPINK6蛋白在皮肤角质层细胞中高表达，并可以通过特异性抑制激肽释放酶(Kallikrein，KLK)家族成员的活性抑制皮屑脱落与皮肤炎症的发生。KLK是ー组高度保守的丝氨酸蛋白酶家族的ー个亚群，广泛存在于各种组织和体液中，參与多种生理和病理过程。目前已发现15个KLK家族成员KLK1-15，其分子的异常表达被证明与多种疾病发生过程相关，如高血压，肾功能障碍，皮肤病变，炎症，中枢系统疾病以及肿瘤发生。其中，KLK表达与肿瘤发生发展的关系近来越来越被人们重视。其中KLK3(PSA)作为前列腺癌的诊断指标得到了 FDA批准并得到了广泛的临床应用。目前，KLK的作用在众多激素依赖性肿瘤方面得到了证实，KLK2，KLK3 (PSA)，KLK5，KLK6，KLKlO和KLKll已相继被确定为卵巣癌，乳腺癌，前列腺癌的标志物。大量研究表明，KLK可通过激活生长因子、促进血管生成、激活蛋白酶降解细胞外基质成分等參与肿瘤的侵袭转移过程。KLK蛋白能直接或间接地水解胞外基质蛋白，促进肿瘤细胞的游离，浸润和转移。研究显示KLK能分解大分子的胞外基质蛋白如胶原蛋白，纤连蛋白，层连蛋白，玻璃体结合蛋白等，促进肿瘤转移。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂LEKT1-1，2，在皮肤，免疫系统中被证明可以有效抑制KLK活性。我们前期研究结果发现，SPINK6蛋白在肝癌细胞系中的高表达可以有效抑制肝癌细胞系的生长，迁移侵袭，并可以完全抑制体外软琼脂培养体系和裸鼠体内肿瘤形成。这ー结果表明SPINK6分子可能在肿瘤抑制中发挥了关键性的作用。我们进一歩研究发现，重组SPINK6蛋白加入肿瘤细胞培养体系可以有效抑制多种肿瘤细胞的侵袭能力。2010年U.Meyer-Hoffert等从皮肤角质层细胞中提取了 SPINK6蛋白，并在大肠杆菌中重组表达和纯化了 SPINK6。然而虽然SPINK6广泛存在于各种组织和器官中，但其含量非常少，且很难分离纯化，且不同物种的SPINK6在理化性质和分子结构上存在一定的差异，因此动物来源的蛋白在人体内使用会产生免疫排斥反应。由于SPINK6分子量小并且含有3对分子内ニ硫键，因此在大肠杆菌中很难产生具有正确功能结构的SPINK6，其生物活性难以保证，不能满足实验和临床应用需求。目前迫切需要研发适合エ业化生产的、高活性rhSPINK6的方法。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题之ー是提供ー种高生物活性的rhSPINK6(重组人Kazal 6型丝氨酸蛋白酶抑制剂，Recombinant human serine proteinase inhibitorKazal-type 6)的生产方法。 本专利技术的另ー个目的是提供相应的rhSPINK6编码序列、载体、工程细胞和rhSPINK6的表达和纯化方法。本专利技术的技术方案是这样的:本专利技术提供了一种编码人SPINK6的DNA序列SEQ ID NO:3，所述的DNA序列编码SEQ ID NO:2所示的SPINK6成熟蛋白，而且所述的DNA序列具有以下特征:SEQ ID NO:2中第19位氨基酸的密码子为aga ；SEQ ID NO:2中第26、29和33位氨基酸的密码子为ggt ；SEQ ID NO:2中第50位氨基酸的密码子为tct ；SEQ ID NO:2中第51位氨基酸的密码子为ttg ；本专利技术提供了ー种表达载体PPIC9K-SP6，它含有所述的DNA编码序列SEQ ID NO:3。本专利技术提供了一种毕赤酵母工程细胞GS115，它含有所述的表达载体PPIC9K-SP6。本专利技术提供了一种生产rhSPINK6的方法，包含以下步骤:在合适的诱导条件下，培养毕赤酵母工程细胞GSl 15，从而分泌表达rhSPINK6，通过阳离子交換和凝胶排阻层析纯化出rhSPINK6。通过蛋白酶抑制试验检测纯化后酵母表达的rhSPINK6的生物活性，它比大肠杆菌表达的rhSPINK6具有更强的抑制活性(见实施例4)。附图说明图1 rhSPINK6的基因优化的表达质粒pPIC9K_SP6。图2 rhSPINK6的表达分析。(a) SDS-PAGE分析.泳道1，pPIC9K空白质粒的表达上清.泳道2_6，阳性克隆经0.5%的甲醇诱导72h后的上清。泳道9，蛋白分子量Marker, (b)表达上清抑制KLK14的活性检测.No 1，阴性对照.No 2-6，阳性克隆.空白对照，0.1M Tris-CKpH 8.0).图3 rhSPINK6的优化表达。(a)pH.(b)诱导温度.图4 rhSPINK6 的电泳图。泳道I，经阳离子交换纯化的rhSPINK6.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码人SPINK6的DNA序列(SEQ?ID?NO：3)，其特征在于，该序列编码了SEQ?IDNO：2所示的SPINK6成熟蛋白，并且还具有以下特征：SEQ?ID?NO：2中第19位氨基酸的密码子为aga；SEQ?ID?NO：2中第26、29和33位氨基酸的密码子为ggt；SEQ?ID?NO：2中第50位氨基酸的密码子为tct；SEQ?ID?NO：2中第51位氨基酸的密码子为ttg。
【技术特征摘要】
1.种编码人SPINK6的DNA序列(SEQ ID NO:3)，其特征在于，该序列编码了 SEQIDNO:2所示的SPINK6成熟蛋白，并且还具有以下特征: SEQ ID NO:2中第19位氨基酸的密码子为aga ； SEQ ID NO:2中第26、29和33位氨基酸的密码子为ggt ； SEQ ID NO:2中第50位氨基酸的密码子为tct ； SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆海荣，黄青山，黄晋江，李斌宾，
申请(专利权)人：复旦大学，上海高科联合生物技术研发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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