本发明专利技术公开了一种基于核酸适体的可捕获癌细胞的微流控芯片，由上层聚合物芯片和下层玻片载体可逆封接而成，两者之间设有细胞捕获通道，通道底表面表现为凹凸不平；底表面上固定有亲和素。微流控芯片的制备包括以下步骤：先通过光刻制作芯片模具，再浇铸得到聚合物芯片；玻片载体经氢氟酸处理后与聚合物芯片键合；最后在细胞捕获通道内固定亲和素制得微流控芯片。本发明专利技术的微流控芯片可用于癌细胞的分离，分离时先向样本中加入修饰有生物素的核酸适体，孵育；将孵育后的混合溶液通入微流控芯片中，混合溶液中的目标癌细胞通过生物素与亲和素的结合，实现对目标癌细胞的分离。本发明专利技术具有细胞捕获效率高、操作简便、通用性强、成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及 一种细胞分离技术，尤其涉及一种可用于癌细胞分离的微流控芯片和分离方法。
技术介绍
癌症，亦称恶性肿瘤，其是因控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分，严重威胁人类健康。癌细胞的捕获，尤其是从原生癌细胞组织上脱落下来进入人体外周血液及组织中的循环癌细胞的捕获，对于癌症的早期诊断、治疗效果的评估有极其重要的意义。在过去的几十年间，人们开发了很多种用以捕获癌细胞的技术，如:荧光免疫法、磁性免疫法等。然而，这些技术所需的仪器昂贵，操作方法复杂，推广难度大。因此，开发一种小型、廉价、操作简单的癌细胞捕获仪器是非常有意义的。微流控芯片技术由于制作成本低、试剂消耗少、检测速度快、功能集成度高等优点越来越受到研究人员的关注。人们已经逐步利用微流控芯片实现了对循环癌细胞的高通量筛选、计数以及表征等技术。Faley S等利用440个18 μ mX 18 μ mX 10 μ m的聚二甲基娃氧烧(Polydimethylsiloxane, PDMS)微结构捕获阵列成功地实现了对OM+T细胞的捕获(Faley S，Seale K, Hughey J et al, Microfluidic Platform for Real-TimeSignaling Analysis of Multiple Single T Cells in Parallel, Lab on a Chip, 2008，8，1700-1712)。该设计侧向2 μ m宽的微小狭缝使得PDMS在脱模时容易断裂，另外芯片对细胞捕获的选择性不高，会将全血中的红细胞、白细胞和癌细胞同时捕获。这些方法基本上都是基于细胞大小等物理性质、或是基于抗原抗体相互作用的识别分离，所以都没能实现既有高效率、又有高特异性的捕获。核酸适体(aptamer)是一种从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。1990年Gold研究组运用体外筛选技术获得能与T4 DNA聚合酶特异性结合的RNA，并把该技术定义为指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)。基于SELEX筛选获得的核酸适体具有比抗体更好的化学性质，能够高效、特异地结合多种目标物质，具有制备修饰简便快速、稳定性好、无毒性、无免疫原性等优点，在生物医学基础研究和临床诊断与治疗方面显示出巨大的应用前景。Joseph A.Phillips等用核酸适体作为捕获探针有效地实现了癌细胞的分离和富集(Joseph A.Phillips, Ye Xu, Zheng Xia et alEnrichment of cancer cells using aptamers immobilized on a microfluidic channelAnal.Chem.2009, 81，1033-1039)，但该方法由于芯片结构简单，不能很好地解决层流的影响，另外由于核酸适体预先固定在芯片上，其与细胞接触几率小，这使得低浓度下的捕获效率不高。因此，迫切需要开发一种制作简单、操作方便的细胞捕获分选芯片，以期能够实现高效且高特异性地捕获样品中微量癌细胞的目标。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种细胞捕获效率高、制作工艺简单、操作简便、通用性强、成本低、能在全血中捕获癌细胞的微流控芯片，还提供一种基于该微流控芯片的快速、准确的癌细胞的分离方法。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种基于核酸适体的可捕获癌细胞的微流控芯片，所述微流控芯片由上层聚二甲基娃氧烧(Polydimethylsiloxane, PDMS)聚合物芯片和下层的玻片载体可逆封接而成，所述微流控芯片上设有进样口和出样口，所述PDMS聚合物芯片和玻片载体之间设有蛇形状的细胞捕获通道，所述细胞捕获通道将所述进样口和出样口连通，所述细胞捕获通道的内上表面设有自上往下突出的鱼骨形结构，所述细胞捕获通道的底表面为凹凸不平的玻片载体表面；所述细胞捕获通道的底表面上固定有亲和素。上述的微流控芯片中，所述凹凸不平的玻片载体表面是经过氢氟酸腐蚀处理后成型得到。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种微流控芯片的制备方法，包括以下步骤: (1)PDMS聚合物芯片:先用绘图软件绘制PDMS聚合物芯片掩膜版图，并使用高分辨率激光打印机打印在透明胶片上制得光刻掩膜板，然后利用此光刻掩膜板并通过光刻工艺制作得到芯片模具； (2)PDMS浇铸:将PDMS前聚体与固化剂按常规质量比(例如10: I)进行物理混合，充分搅拌，真空脱气后浇铸在上述步骤(I)制得的芯片模具上，烘干固化后冷却，得到PDMS聚合物芯片； (3)氢氟酸处理:将氢氟酸溶液均匀涂覆在一洁净的玻璃表面，静置一段时间(5s 5min)后用水洗净，用氮气吹干，得到玻片载体；通过采用氢氟酸腐蚀玻璃表面，能够增大玻璃表面的粗糙度，提高细胞捕获通道的底表面面积，进而提高亲和素的修饰密度，进一步破坏层流增大细胞与基底的接触几率，达到增大目标细胞捕获效率的目的； (4)键合:将步骤(2)制得的PDMS聚合物芯片与步骤(3)制得的玻片载体加压可逆键合，得到半成品； (5)亲和素的修饰:将含有亲和素的磷酸缓冲液通过半成品的进样口通入到半成品的细胞捕获通道内，使其在细胞捕获通道中孵育，再用结合缓冲液冲洗，制得微流控芯片。上述的制备方法，所述步骤(2)中，烘干固化的温度优选为70°C 90°C，热烘时间优选为2 6小时。上述的制备方法，所述步骤(3)中，氢氟酸溶液的体积分数优选为10% 40%。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种癌细胞的分离方法，包括以下步骤: (I)向含有目标癌细胞的样本中加入核酸适体溶液，将混合溶液置于冰上孵育；所述核酸适体溶液中含有的核酸适体是可与目标癌细胞进行特异性反应结合的核酸适体，该核酸适体一般选自DNA、RNA中的一种或多种,且在该核酸适体序列的3’端修饰有生物素；基于SELEX筛选获得的核酸适体，具有比传统的捕获探针抗体更好的化学性质，能够高效、特异地结合多种目标物质，具有制备修饰简便快速、稳定性好、无毒性、无免疫原性等优点； (2 )将步骤(I)中孵育后的混合溶液通入上述微流控芯片的进样口中，使混合溶液在所述细胞捕获通道内流动，室温下孵育，混合溶液中含有的目标癌细胞通过所述生物素与亲和素的结合反应，被捕获到所述微流控芯片的玻片载体表面，混合溶液中的其他成分则通过所述出样口流出，实现对目标癌细胞的分离。上述的分离方法中，所述目标癌细胞包括各种类型的癌细胞，优选是指淋巴癌细胞、肺癌细胞或肝癌细胞；所述样本甚至可以为复杂的人体全血样本。通过采用本专利技术的分离方法对含目标癌细胞的样本进行分离，这不仅为各种癌细胞的后续科学研究提供了手段和前提，而且借助荧光分析等现有技术可以有效实现对癌细胞的定性和定量检测。上述的癌细胞的分离方法，所述步骤(2)中，混合溶液优选是以0.5 mL/h 3 mL/h的流速通入到微流控芯片的进样口中；室温下孵本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于核酸适体的可捕获癌细胞的微流控芯片，所述微流控芯片由上层PDMS聚合物芯片和下层的玻片载体可逆封接而成，所述微流控芯片上设有进样口和出样口，所述PDMS聚合物芯片和玻片载体之间设有蛇形状的细胞捕获通道，所述细胞捕获通道将所述进样口和出样口连通，所述细胞捕获通道的内上表面设有自上往下突出的鱼骨形结构，其特征在于：所述细胞捕获通道的底表面为凹凸不平的玻片载体表面；所述细胞捕获通道的底表面上固定有亲和素。
【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适体的可捕获癌细胞的微流控芯片，所述微流控芯片由上层PDMS聚合物芯片和下层的玻片载体可逆封接而成，所述微流控芯片上设有进样口和出样口，所述PDMS聚合物芯片和玻片载体之间设有蛇形状的细胞捕获通道，所述细胞捕获通道将所述进样口和出样口连通，所述细胞捕获通道的内上表面设有自上往下突出的鱼骨形结构，其特征在于:所述细胞捕获通道的底表面为凹凸不平的玻片载体表面；所述细胞捕获通道的底表面上固定有亲和素。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述凹凸不平的玻片载体表面是经过氢氟酸腐蚀处理后成型得到。3.一种微流控芯 片的制备方法，包括以下步骤: (1)PDMS聚合物芯片:先用绘图软件绘制PDMS聚合物芯片掩膜版图，并使用高分辨率激光打印机打印在透明胶片上制得光刻掩膜板，然后利用此光刻掩膜板并通过光刻工艺制作得到芯片模具； (2)PDMS浇铸:将PDMS前聚体与固化剂按常规质量比进行物理混合，充分搅拌，真空脱气后浇铸在上述步骤(I)制得的芯片模具上，烘干固化后冷却，得到PDMS聚合物芯片； (3)氢氟酸处理:将氢氟酸溶液均匀涂覆在一洁净的玻璃表面，静置后用水洗净，用氮气吹干，得到玻片载体； (4)键合:将步骤(2)制得的PDMS聚合物芯片与步骤(3)制得的玻片载体加压可逆键合，得到半成品； (5)亲和素的修饰:将含有亲和素的磷酸缓冲液通过半...
【专利技术属性】
技术研发人员：羊小海，王青，王柯敏，赵庆，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。