用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物及其制备方法和应用，所述穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在或者穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。本发明专利技术通过大量实验筛选，优选出最佳的氨基酸序列与肉毒毒素进行组合，另外本发明专利技术还通过大量实验将穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得融合蛋白质，通过经皮扩散实验研究表明，本发明专利技术提供的基于穿膜肽介导下的肉毒毒素转运速率与透过率明显高于现有技术的肉毒毒素外用给药制剂，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肉毒毒素的制剂，具体涉及ー种穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物及其制备方法和其应用，应用于经皮给药系统和化妆品领域。
技术介绍
穿膜肽是ー些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，长度一般不超过30个氨基酸，可携帯比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞，毒副作用小。穿膜肽可以通过共价键或非共价键等方式携帯生物大分子物质透过细胞膜，如将蛋白质类、多肽类等大分子生物活性物质递送进入细胞内从而发挥治疗作用。肉毒毒素是肉毒杆菌产生的毒素，具有強烈的神经毒性，其生物学作用是在神经肌接头处阻滞神经末梢释放こ酰胆碱，从而治疗痉挛、強直等疾病。自1992年报道肉毒毒素在治疗眼肌痉挛时，同`时具有消除皱纹的作用，从此开创了肉毒毒素在美容领域的应用。2002年4月FDA批准肉毒毒素可以用于化妆品中，其效果显著、安全性高的特点受到广泛关注。目前肉毒毒素的主要给药途径为皮下注射或肌肉注射，肉毒毒素注射剂通过在面部肌肉内注射起到去除皱纹的治疗效果，面部肌肉包括皱眉肌、降眉肌、眼轮匝肌、颞肌等，目前对于注射用肉毒毒素在临床的使用的安全性和耐受性存在一定问题，且存在患者使用的顺应性不好等问题。因此，急需将肉毒毒素开发为新型的经皮给药制剂，基于穿膜肽的经皮转运作用，能促进肉毒毒素穿过皮肤屏障，达到作用部位，用于治疗包括眉间皱纹、鼻唇线、鱼尾纹、嘴角纹和抬头纹等，提高药物使用的安全性和顺应性，降低药物的毒副作用及耐受性。现有研究通过将A型肉毒毒素与HIV-TAT穿膜肽进行组合，用于A型肉毒毒素的局部施用和透皮递送，但是任然存在透皮吸收率差，应用范围较差等缺点。因此，为了进ー步地提高肉毒毒素的透皮吸收率，很有必要在现有技术的基础上设计研发一种透皮吸收率更高的肉毒毒素的外用经皮给药制剂。
技术实现思路
专利技术目的:本专利技术的目的是解决现有技术的不足，通过大量实验筛选，提供ー种高效透过率的穿膜肽与肉毒毒素进行组合，或将穿膜肽与肉毒毒素形成融合蛋白的方式，获得高透过率的穿膜肽介导的肉毒毒素外用经皮给药制剂。技术方案:为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为: 一种用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，所述穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在或者穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在时，所述的穿膜肽的氨基酸序列为精氨酸的直链聚合物Rn，其中n = 3 16。本专利技术通过大量实验，筛选了大量不同的氨基酸序列，实验结果表明，当肉毒毒素与精氨酸的直链聚合物Rn (其中n = 3 16)组合时，肉毒毒素的透皮转运速率与透过率显著高于现有技术的肉毒毒素经皮给药系统。作为另ー优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在时，所述的穿膜肽的序列为精氨酸的直链聚合物Rn，其中n = 3 16。作为另一更优选方案，穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在时，所述的穿膜肽的序列为具有HIV-1转录激活因子Tat蛋白转导结构域Tat_PTD49_57 序列片段。 作为优选方案，穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得的融合蛋白质，具体方法为:采用PCR方法扩增出穿膜肽与A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法连接后将扩增产物和大肠杆菌表达质粒pET-22b用限制性内切酶EcoR I以及Xho I双酶切后连接，并转化至大肠杆菌DH5ci中，用氨苄青霉素筛选阳性克隆，抽提经测序鉴定正确的重组质粒，转化至大肠杆菌BL21中，利用氨苄青霉素抗性筛选出构建成功的转化子，在37°C经IPTG诱导4小时后，收获融合蛋白并使用Ni亲和层析柱进行分离纯化，获得穿膜肽与A型肉毒毒素的融合蛋白。穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得的融合蛋白质，其中所述肉毒毒素融合蛋白质以约5単位到约为3000単位的量存在于所述的外用经皮给药制剂中。为了更好的促进肉毒毒素的透皮转运与透过，本专利技术通过大量实验筛选研究，结果表明，当穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得的融合蛋白质时，其透皮转运速率与透过率得到明显提高，取得了非常好的技术效果。作为优选方案，所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，所述的肉毒毒素未A、B、C、D、E、F或G型肉毒毒素。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，将穿膜肽与肉毒毒素的组合物或者穿膜肽与肉毒毒素形成的融合蛋白采用天然或合成的磷脂包裹制备成脂质体。实验结果表明，穿膜肽介导的肉毒毒素包裹制备成脂质体时，较未被脂质体包裹的肉毒毒素相比，其透皮转运速率与透过率得到明显提高，因此本专利技术可以将穿膜肽介导的肉毒毒素包裹制备成脂质体，方便用于经皮给药系统。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，所述的外用制剂为溶液剂、软膏剂、凝胶剂、乳剂、霜剂、气雾剂或贴剂。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，穿膜肽与肉毒毒素形成的组合物，外用制剂中含有肉毒毒素5単位到3000単位，外用制剂中穿膜肽的重量百分含量为0.01% 40%。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物在制备治疗眉间皱纹、鼻唇线、鱼尾纹、嘴角纹或抬头纹医学或美容病症中的应用。有益效果:本专利技术提供的组合物和现有技术相比具有以下优点: 本专利技术通过大量实验筛选，优选出最佳的氨基酸序列与肉毒毒素进行组合，另外本专利技术还通过大量实验将穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得融合蛋白质，通过经皮扩散实验研究表明，本专利技术提供的基于穿膜肽介导下的肉毒毒素转运速率与透过率明显高于现有技术的肉毒毒素外用给药制剂，具有很好的应用前景。具体实施例方式下面结合具体实施例进ー步阐明本专利技术，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例1 R8 (8聚精氨酸)介导的肉毒毒素凝胶剂的制备 取I g卡波姆940，加蒸馏水适量，搅拌均匀后放置充分溶胀，得卡波姆凝胶溶液，然后取10单位的A型肉毒毒素,加入2 mL PBS缓冲液中，得到A型肉毒毒素溶液,然后采用固相合成法合成穿膜肽R8 (8聚精氨酸)，取I g R8 (8聚精氨酸)穿膜肽，溶解于2 mL PBS缓冲液中，得R8 (8聚精氨酸)穿膜肽溶液。将5 g丙ニ醇、10 gこ醇加入至上述卡波姆凝胶中，边加边搅拌，以三こ醇胺调pH至6.(T7.0，再以蒸馏水加至约90 g吋，将A型肉毒毒素PBS溶液和R8穿膜肽PBS溶液加入至凝胶中，充分搅拌混匀后，以蒸馏水加至100 g，即得A型肉毒毒素凝胶剂。实施例2 Tat_PTD49_57与肉毒毒素融合蛋白的制备 表达和纯化含有Tat-PTD49_57蛋白转导结构域(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)与A型肉毒毒素的融合蛋白质。采用PCR方法扩增出穿膜肽与A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法连接后将扩增产物和大肠杆菌表达质粒pET_22b (Novagen, c0.Ltd.，USA)用限制性内切酶EcoR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，所述穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在或者穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。

【技术特征摘要】
1.一种用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，所述穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在或者穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。2.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在干，穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在时，所述的穿膜肽的氨基酸序列为精氨酸的直链聚合物Rn，其中n = 3 16。3.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在时，所述的穿膜肽的序列为精氨酸的直链聚合物Rn，其中n = 3 16。4.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在时，所述的穿膜肽的序列为具有HIV-1转录激活因子Tat蛋白转导结构域Tat_PTD49_57序列片段。5.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，通过基因重组的方式获得穿膜肽与肉毒毒素的融合蛋白，具体方法为:采用PCR方法扩增出穿膜肽与A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法连接后将扩增产物和大肠杆菌表达质粒pET-22b用限制性内切酶EcoR I以及Xho I双酶切后连接，并转化至大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘睿，吴皓，程建明，卞慧敏，王令充，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：