核酸捕获和测序方法技术

本发明专利技术提供了捕获和测序靶核酸分子的方法。并提供了测定基因组DNA的甲基化状态的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从核酸混合物中分离靶核酸分子和测定这些分子的序列。背景自全部人基因组序列完成后，基因组研究已转向“再测序(resequencing)”研究，其中在基因组中和基因组间鉴定变异，例如疾病相关突变。富含特定目的区域(例如外显子)的“分区”基因组的再测序需要涉及“捕获”和测序这些区域的若干步骤。例如，在某些基于微阵列的方法中，基因组DNA被剪切为特定大小范围的片段；末端修复所述片段，与独特的接头(adaptor)连接，并扩增；然后使用包含与参考目的基因组序列互补的探针的微阵列捕获扩增的片段；洗脱和扩增捕获的(杂交的)片段；测序扩增的片段，例如使用“下一代(next generation)”测序技术或再测序阵列。见,例如W02008/115185;Okou等人(2007)Nature Methods4:907-909; Hodges 等人(2007) Nature Genetics39:1522-1527。减少分离和测序目的核酸所需的步骤将提高效率和准确性，且可能降低成本。本专利技术满足了此要求并提供了额外的益处。一般在基因组中的CpG 二核苷酸处出现的胞嘧啶甲基化在基因调控和表观遗传(epigenetic inheritance)中起重要作用。测定基因组区域的甲基化状态的某些现有方法利用亚硫酸氢盐(bisulfite)处理。在这些方法中，将变性的基因组DNA暴露于亚硫酸氢根离子导致胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶受保护免于此转化。可例如通过下一代测序方法或通过使用 探针阵列检测转化事件的存在与否。见，例如，W02010/085343。这样的方法经常需要若干步骤，例如扩增、捕获、洗脱和测序亚硫酸氢盐处理的DNA，或者备选地需要设计探针，以检测每个目的基因组区域处的转化事件的存在与否，这可能是昂贵和费力的。此外，这样的方法不能在个体DNA分子水平上评估甲基化状态，而是检查对应特定目的基因组区域的核酸分子群。本专利技术提供了更有效和准确的评估基因组DNA的甲基化状态的方法，因此满足了本领域的需要并提供了其他益处。概述在一个方面，本专利技术提供了捕获和测序靶核酸分子的方法，所述方法包括(a)在杂交条件下将固相支持物暴露于包含靶核酸分子的核酸混合物，其中靶核酸分子与固定在固相支持物上的处于能够引发延伸(priming-competent)的构型中的引物形成特异性杂交复合物；(b)从固相支持物上分离未结合的和非特异性结合的核酸；(C)在聚合条件下将固相支持物暴露于聚合酶和核苷酸；和(d)通过检测使用靶核酸分子作为模板，通过聚合酶从固定引物起始的核酸聚合，测定靶核酸分子的核酸序列。在一个实施方案中，靶核酸分子来自基因组DNA区域。在一个这样的实施方案中，靶核酸包含外显子的全部或部分。在另一个实施方案中，靶核酸分子是RNA，聚合酶是逆转录酶，引物包含3’多聚T序列。在另一个实施方案中，靶核酸分子是DNA，聚合酶是DNA聚合酶。在另一个实施方案中，在核苷酸的末端磷酸上标记核苷酸。在一个这样的实施方案中，用FRET供体标记聚合酶，用FRET受体标记核苷酸。在一个这样的实施方案中，FRET供体是荧光纳米颗粒。在另一个方面，提供了测定基因组DNA片段的甲基化状态的方法，所述方法包括(a)在固相支持物上固定基因组DNA片段；(b)通过检测使用固定的基因组DNA片段作为模板，通过聚合酶的核酸聚合，测定固相支持物上固定的基因组DNA片段的核酸序列；(c)对固定的基因组DNA片段进行亚硫酸氢盐处理；(d)通过检测使用固定的亚硫酸氢盐处理的基因组DNA片段作为模板，通过聚合酶的核酸聚合，测定固相支持物上固定的亚硫酸氢盐处理的基因组DNA片段的核酸序列；(e)比较在(b)中测定的核酸序列和在(d)中测定的序列，其中在基因组DNA片段中胞嘧啶残基的转化指示这些残基在亚硫酸氢盐处理前在基因组DNA片段中是未甲基化的，且其中在基因组DNA片段中不存在胞嘧啶残基转化指示这些残基在亚硫酸氢盐处理前在基因组DNA片段中是甲基化的。在一个实施方案中，通过接头将基因组DNA片段固定在固相支持物上。在一个这样的实施方案中，接头包含引物结合位点，且在引物结合位点中的胞嘧啶是受保护的。在一个这样的实施方案中 ，(b)和/或(d)的聚合酶从与引物结合位点退火的引物起始聚合核酸链。在另一个实施方案中，通过检测标记核苷酸的掺入，检测(b)和/或(d)中的核酸聚合。在一个这样的实施方案中，标记核苷酸在其末端磷酸上被标记。在一个这样的实施方案中，(b)和/或(d)的聚合酶用FRET供体标记，核苷酸用FRET受体标记。在一个这样的实施方案中，FRET供体是荧光纳米颗粒。附图简述附图说明图1描述了使用互补的寡核苷酸在寡核苷酸阵列上直接捕获剪切的DNA的选定区域，和通过使用用于捕获DNA的寡核苷酸的游离3’末端、允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基(序列)和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP直接测序捕获的DNA。图2描述了使用用互补的寡核苷酸包被的小珠直接捕获剪切的DNA的选定区域，随后阵列小珠和通过使用用于捕获DNA的寡核苷酸的游离3’末端、允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基(序列)和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP测序捕获的DNA。图3描述了在多聚dT寡核苷酸阵列上直接捕获RNA，和通过使用多聚dT寡核苷酸的游离3’末端和逆转录酶将其转化为cDNA测序捕获的RNA。在cDNA转化后，使用多聚A引物，允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基(序列)和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP测序cDNA。备选地，可使用允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基(序列)和逆转录酶的标记的逆转录酶和标记的dNTP直接测序捕获的RNA以得到序列。图4描述了使用固定在小珠上的多聚dT寡核苷酸直接捕获RNA，在表面上阵列小珠，然后通过使用多聚dT寡核苷酸的游离3’末端和逆转录酶将其转化为cDNA测序捕获的RNA。在cDNA转化后，使用多聚A引物，允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基(序列)和逆转录酶的标记的聚合酶和标记的dNTP测序cDNA。备选地，可使用允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基(序列)和逆转录酶的标记的逆转录酶和标记的dNTP直接测序捕获的RNA以得到序列。图5描述了通过测序在连续反应中在阵列上的相同的DNA分子，测定核酸甲基化状态，其中第二轮测序在亚硫酸氢盐处理后进行，以允许甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。合适的引物、标记的聚合酶和标记的dNTP允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基(序列)和聚合酶。图6描述了通过测序在连续反应中在小珠上的相同的DNA分子，测定核酸甲基化状态，其中第二轮测序在亚硫酸氢盐处理后进行，以允许甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。合适的引物、标记的聚合酶和标记的dNTP允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基(序列)和聚合酶。专利技术实施方案详述1.定义“亚硫酸氢盐处理”指将核酸暴露于足以将未受保护的胞嘧啶转化为尿嘧啶的浓度的亚硫酸氢根离子(例如，亚硫酸氢镁或亚硫酸氢钠)。“亚硫酸氢盐处理”也指将核酸暴露于合适浓度的可用于将未受保护的胞嘧啶转化为尿嘧啶的其他试剂，例如亚硫酸氢盐(disulfi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.27 US 61/402,3501.捕获和测序靶核酸分子的方法，其包括:(a)在杂交条件下将固相支持物暴露于包含靶核酸分子的核酸混合物，其中靶核酸分子与固定在固相支持物上的处于能够引发延伸的构型中的引物形成特异性杂交复合物；(b)从固相支持物上分离未结合的和非特异性结合的核酸；(C)在聚合条件下将固相支持物暴露于聚合酶和核苷酸；和(d)通过检测使用靶核酸分子作为模板，通过聚合酶从固定引物起始的核酸聚合，测定靶核酸分子的核酸序列。2.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子来自基因组DNA区域。3.权利要求2的方法，其中所述靶核酸包含外显子的全部或部分。4.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子是RNA，所述聚合酶是逆转录酶，且所述引物包含3’多聚T序列。5.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子是DNA，且所述聚合酶是DNA聚合酶.6.权利要求1的方法，其中所述核苷酸在其末端磷酸上被标记。6. 原文丢失7.权利要求6的方法，其中所述聚合酶用FRET供体标记，所述核苷酸用FRET受体标记。8.权利要求7的方法，其中所述FRET供体是荧光纳米颗粒。9.测定基因组DNA片段的甲基化状态的方法，所述方法包括:(a)在固相支持物上固定基因组DNA片段；(b)通过检测使用固定的基因组DNA片段作...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·塞沙基里，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：
国别省市：