本发明专利技术涉及使用如乙二醛、丁二酮和苯甲酰甲醛等α-二羰基类毒素化试剂制备的类毒素的应用。所述类毒素可以用低浓度的类毒素化试剂在短的时间内、通常在少至24小时中制得，使得所述类毒素化试剂在与传统甲醛类毒素化相比时特别有利。本发明专利技术描述了使用如苯甲酰甲醛等二羰基试剂制得的类毒素，并要求保护包含所述类毒素的药物和疫苗组合物，使用此类组合物的治疗方法和通过用所述类毒素免疫接种产生的抗体以及使用如此制备的抗体的治疗方法或此类抗体的片段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及类毒素和从毒素制备类毒素的方法。本专利技术的类毒素特别可用于使用该类毒素进行治疗性或预防性治疗中毒，或用于使用该类毒素制备包含通过疫苗接种产生抗体的治疗剂。类毒素疫苗和抗类毒素抗体治疗物或者抗毒素构成了本专利技术的其它方面。毒素是由活细胞或生物体产生的有毒物质，虽然毒素通常被认为是植物、动物、微生物(包括但不限于细菌、病毒、真菌、立克次体或原生动物)的毒性多肽或蛋白产物，但术语毒素还包括模拟此类毒性多肽和蛋白的重组或合成分子(不论来源或制备方法如何)。毒素通常在接触或为身体组织吸收时导致疾病，其后毒素充当抗原并与酶和细胞受体等相互作用。毒素在其严重性方面差异很大，其范围从通常的轻微和急性(例如，蜜蜂蛰刺)到几乎立即致命(例如，肉毒菌和蓖麻毒蛋白毒素)。许多蛇的毒液含有强力毒素。某些毒素的严重性结合其相对较简单的提取或制备方法已经引发人们越来越多地关注毒素可能为恐怖分子或军事入侵者利用。类毒素是失活的毒素。也就是，其中毒性已经破坏但保留了诱导对毒素的免疫应答性质(例如，通过在宿主动物中产生抗体应答)的毒素。为此，类毒素通常用作疫苗以保护哺乳动物不受毒素的影响，类毒素还用于制备抗毒素，即由对类毒素的免疫应答产生的抗体或抗体产物。类毒素通常通过毒素的化学失活产生,例如,通过毒素内的个别氨基酸残基的直接化学反应产生。已经使用甲醛制备了数种毒素的类毒素，已知甲醛主要与毒素蛋白中的赖氨酸反应。已经通过与甲醛反应成功地使蓖麻毒蛋白和肉毒菌毒素类毒素化(失活)，并且现今已利用甲醛失活产生了针对这些毒素的疫苗和抗毒素疗法。然而，采用甲醛的类毒素化(toxoiding)并非易事。毒素通常在较高温度(通常30°C 37°C )于较长时间段(通常7天以上)用低浓度(0.2% 0.6%)的甲醛进行透析。例如，蓖麻毒蛋白的甲醛失活通常通过用甲醛(37体积％)在37°C对蓖麻毒蛋白(lmg/mL)温育21天来完成。因此，就 制造而言(超出实验室规模)，甲醛失活耗时并且成本高昂。另外，甲醛与毒素的反应复杂，且其通常难以获得毒素的完全去除。因此，用甲醛产生的类毒素具有以下不利性质，即如果储存不当，类毒素可能逆转为活性毒素。这一问题已经在市售的白喉和破伤风系类毒素疫苗中通过在最终组合物中包含少量甲醛而得到克月艮。然而，这不是有利的，因为甲醛已经被划分为可能的人致癌物。还常见的是，甲醛失活产生毒素的较大构象变化，这使得类毒素在免疫学上不与该毒素相似并且缺乏某些中和性表位，而这最终会影响类毒素产生有用抗体的能力。甲醛的替代物是已知的，例如国际专利申请第PCT/GB2006/000466号(公开号W02006/085088)中所描述，其描述了使用碘代乙酰胺使肉毒菌毒素失活。碘代乙酰胺是强烷基化剂，虽然其具有使毒素中的半胱氨酸残基不可逆地烷基化的能力，但其也被鉴定为疑似致癌物并且已知其为光敏性化合物，而这可能限制其在大规模制备类毒素中的应用。因此，仍然需要开发出可以克服现存的类毒素化试剂的缺陷的类毒素化试剂。理想的是，此类类毒素化试剂可安全且稳定地操作，并且具有使毒素完全失活的能力而没有使之逆转为其毒性形式的风险，从而无需在任何类毒素药物组合物中包含残留量的类毒素化试剂(或如甲醛等其它试剂)。理想的是，使毒素完全失活的时长比用甲醛类毒素化所需的时间少得多，并且具有在室温实施而无需苛刻反应条件的潜力。本专利技术人意外地发现，可以通过使毒素、特别是蛋白毒素通过使该毒素与合适量的具有通式结构R-C (O) C (O) R’的α-二羰基化合物反应而完全失活。这种类毒素制备方法快速，类毒素可在数小时而非数日中即可制得。合宜的是，类毒素可以在24小时以下制得。类毒素化试剂的需要量相对较少，从而可以使用比传统甲醛类毒素化所用的浓度更低的浓度来实现反应。使用通式为R_C(0)C(0)H(即其中R’为H)的α-二羰基醛制备的类毒素特别有效、稳定、具有免疫原性并且具有与毒素相当(即基本没有改变)的二级结构，其中苯甲酰甲醛是此类α-二羰基醛类毒素化试剂的一个实例。本专利技术以及本文中例举的类毒素可以用作由形成所述类毒素的毒素所致中毒的治疗性或预防性治疗用疫苗，并特别可用于制备转而可用来治疗中毒的治疗性抗毒素。因此，在第一方面，本专利技术提供了源自毒素的类毒素，其中所述毒素内的精氨酸残基已与具有如下所述的通式结构R-C(0)C(0)R’的α - 二羰基化合物进行化学反应:[R-C(O)C(O)Rj ]其中R、R’ =Η、烷基、具有取代基的烷基、芳基或具有取代基的芳 基结构式A (参见附图说明图1)二羰基化合物类毒素化试剂可以是落入上述通式结构的任何可能的化合物。例如，结构式A中的R或R’可以为氢或任何烷基或芳基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、环戊基、己基、环己基、苯基等(或这些基团的支化或具有取代基的变体)。因此，合宜的是，类毒素化试剂可以选自由乙二醛、丙酮醛、丁二酮、1，2-环己二酮、苯甲酰甲醛、4-氟苯甲酰甲醛、4-硝基苯甲酰甲醛和4-羟基苯甲酰甲醛组成的组，所有这些目前均可商购获得。本专利技术提供了 R’为氢的优选实施方式，从而使类毒素化剂落入酮醛的一般类别。特别优选的二羰基(酮醛)化合物是苯甲酰甲醛(图1)。此前已经表明苯甲酰甲醛会与蛋白的精氨酰残基进行选择性反应以产生(精氨酸的)每个胍基含有两个苯甲酰甲醛基的产物，但本专利技术人意外地发现苯甲酰甲醛对精氨酰残基具有高度特异性以至于所产生的类毒素被完全且不可逆地失活并且具有高度免疫原性，而且毒素/类毒素的构象结构未发生显著改变。不希望受缚于理论，据认为类毒素化反应遵循两个步骤。第一步据预期为一个胍氨基与乙二醛中位阻最小的碳原子(即苯甲酰甲醛或4-羟基苯甲酰甲醛的CHO基团，或丁二酮或环己二酮的两个等同C=O基团之一)的可逆缩合。第二步据预期不容易逆转，其是剩余胍氨基的第二缩合以产生杂环。苯甲酰甲醛(PG)是此类转变的良好试剂，因为电负性的苯羰基会激活位阻较小的CHO基团以进行亲核进攻并促进后续的环化。因此，苯甲酰甲醛的衍生物如4-羟基苯甲酰甲醛等也可以用于制备类毒素。4-羟基苯甲酰甲醛比苯甲酰甲醛具有较低的反应性，但有利的是其水溶性更好。PG的在4位具有吸电子性基团的其它衍生物，例如，4-氰基、4-氟、4-三氟甲基或4-硝基衍生物甚至将比PG反应更快并且具有在数分钟内产生类毒素的潜力。一般而言，具有醛基(CHO)的二羰基类毒素化试剂(即具有通式结构R-C(O)C(O)H)将比具有酮基(C=O)的那些试剂(即具有通式结构R_C(0)C(0)R’)反应更为快速，因此更为优选。本专利技术的二羰基类毒素化试剂、特别是苯甲酰甲醛可以用于制备源自任何来源的毒素的类毒素。例如，蛋白类毒素可以由源自植物的毒素产生。合适的植物毒素包括相思豆蛋白和蓖麻毒蛋白。如下文所示，类毒素化试剂特别可用于制备蓖麻毒蛋白的类毒素。然而，本领域技术人员应该理解，毒素可以同样源自动物或微生物。具体的动物毒素包括但不限于:蛇毒素，如α -金环蛇毒素、β -金环蛇毒素、眼镜蛇毒素、响尾蛇毒素、海蛇毒素、太卡毒素(taicatoxin)和棕网蛇毒素(textilotoxin);蜘蛛毒素，如漏斗网蛛毒素、atracotoxin、智利粉蜘蛛毒素(grammoto本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.16 GB 1011968.31.一种源自毒素的类毒素，所述类毒素用作药物，其中，所述毒素内的精氨酸残基已与通式结构为R-C(O) C(O) R’的α-二羰基化合物进行反应。2.如权利要求1所述的类毒素，其中，所述α-二羰基化合物选自由乙二醛、丙酮醛、丁二酮、1，2-环己二酮、苯甲酰甲醛、4-氟苯甲酰甲醛、4-硝基苯甲酰甲醛和4-羟基苯甲酰甲醛组成的组。3.如权利要求2所述的类毒素，其中，所述α-二羰基化合物是苯甲酰甲醛。4.如权利要求1 3中任一项所述的类毒素,所述类毒素源自植物毒素。5.如权利要求4所述的蛋白类毒素，其中，所述植物毒素是蓖麻毒蛋白。6.如权利要求1 3中任一项所述的类毒素，其中，所述毒素源自动物。7.如权利要求6所述的类毒素,其中,所述毒素是蛇毒素。8.如权利要求1 3中任一项所述的类毒素，其中，所述毒素源自细菌。9.如权利要求8所述的类毒素，其中，所述毒素为肉毒菌毒素、破伤风毒素、白喉毒素、霍乱毒素、百日咳杆菌毒素、假单胞菌内毒素、志贺毒素或志贺样毒素、炭疽毒素或SEB。10.如前述权利要求中任一项所述的类毒素，其中，所述药物为疫苗。11.一种源自毒素的类毒素，所述毒素已与通式结构为R-C (O) C (O) H的Ct-二羰基化合物进行反应，所述类毒素用于所述毒素所致中毒的预防性或治疗性治疗。12.如权利要求11所 述的类毒素，其中，所述α-二羰基化合物选自由乙二醛、丙酮醛、丁二酮、1，2-环己二酮、苯甲酰甲醛、4-氟苯甲酰甲醛、4-硝基苯甲酰甲醛和4-羟基苯甲酰甲醛组成的组。13.如权利要求12所述的类毒素，其中，所述α-二羰基化合物为苯甲酰甲醛。14.如权利要求11 13中任一项所述的类毒素，其中，所述α-二羰基化合物以约0.05mM 约5mM的浓度处于溶液中。15.如权利要求14所述的类毒素，其中，所述α- 二羰基化合物的浓度为约ImM。16.如权利要求11 15中任一项所述的类毒素，其中，所述二羰基化合物处于缓冲至pH为6 14的溶液中。1...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·J·考尔克，G·J·菲利普，G·D·格里菲斯，D·怀特菲尔德，
申请(专利权)人：英国国防部，
类型：
国别省市：
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