利用GST表达体系制备的Fertilin Beta胞外段高效价抗体及应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的Fertilin?Beta胞外段高效价抗体及应用。利用基因工程技术，将Fertilin?Beta基因胞外段克隆到原核表达载体中，经酶切鉴定后，用重组质粒转化大肠杆菌，并IPTG诱导产生GST-Fertilin?Beta融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western?blot检测，并应用免疫荧光检测了Fertilin?Beta蛋白特异性定位于精子头后部。该抗Fertilin?Beta多克隆抗体效价与特异性良好，可以应用于细胞中Fertilin?Beta蛋白的检测并能有效检出Fertilin?Beta蛋白特异性定位于精子头后部，对于系统研究Fertilin?Beta蛋白功能意义重大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程中的DNA重组
，具体涉及利用GST原核表达体系制备GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗体及应用。
技术介绍
受精素β (Fertilin Beta)是一种精子表面特异性跨膜糖蛋白，定位在人类8号染色体上，其特异性的表达在人类睾丸组织和精子中，在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合中发挥重要作用。Fertilin Beta蛋白功能及作用机制应深入的研究和探索:受精素在精卵结合和融合中怎样发挥作用；受精素在精子成熟过程中的促进作用等等。而研究一种新的蛋白质的功能，抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的FertilinBeta蛋白高效价抗体对于系统研究Fertilin Beta在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合中的作用机制意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种能够用于Fertilin Beta蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入研究Fertilin Beta蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。利用基因工程技术，将Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸对应DNA片段克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-Fertilin Beta融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测，并应用免疫荧光检测了 Fertilin Beta蛋白特异性定位于精子头后部。 本专利技术的GST-Fertilin Beta融合蛋白是将利用特殊序列(Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸对应DNA片段)构建GST-Ferti I in Beta融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特异性的GST-Fertilin Beta融合蛋白，这段341-373位氨基酸序列为:Glu Ala He His Phe Ser Gly Val Lys He Phe Ser Asn Cys SerI611Phe Glu Asp Phe Ala His Phe He Ser Lys Gln Lys Ser Gin Cys16 21 26Leu His Asn31其对应核苷酸序列为:gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca60cattttattt caaagcagaa gtcccagtgt cttcacaat99这种GST-Fertilin Beta融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤:第一步，克隆载体的构建从人Fertilin Beta基因全长上应用PCR技术以基因组为模板，扩增得到的目的片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建将克隆质粒和质粒pGEX-4T-l双酶切后，利用回收试剂盒获得Fertilin Beta基因该区片段和载体连接。经 转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的诱导表达和纯化重组质粒PGEX-4T_1/Fertilin Beta转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-Fertilin Beta融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。第四步,兔抗Fertilin Beta抗血清的制备及纯化以纯化的Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500 μ g融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第I次加强免疫,500 μ g纯化的GST-Fertilin Beta融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫I次。于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1: 100000时,颈动脉放血，收集血清。用ProteinA/G纯化抗Fertilin Beta血清，准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱,亲和层析使抗体结合在柱子上,经2次洗漆后,将抗体洗脱，达到纯化目的，SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得该专利技术的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特异性，结果显示该抗体可特异性的与Fertilin Beta蛋白结合。利用Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸基因序列成功构建GST-Fertilin Beta融合蛋白原核表达载体，转化BL21后可高效表达特异性的GST-Fertilin Beta融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST-Fertilin Beta融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性，结果表明抗体效价高达I: 1000000且特异性良好。抗体可应用于精子中Fertilin Beta蛋白的检测，对于系统研究Ferti I in Beta蛋白在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合过程中的作用机制意义重大。另外，Fertilin Beta蛋白为精子表面特异性蛋白，我们制备的FertilinBeta抗体为精子分离研究奠定了基础。附图说明:图1:PCR扩增出的Fertilin Beta基因341-373氨基酸片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；图2:双酶切质粒pGEX-4T-l ；图3:pGEX-4T-l/Fertilin Beta 重组体酶切鉴定结果；图 4:纯化后的 GST 及 GST-Fertilin Beta 融合蛋白 SDS-PAGE 图；图5:ProteinA/G纯化后的Fertilin Beta抗体和纯化前的抗Fertilin Beta血清 SDS-PAGE 图； 图6:间接ELISA法测定抗体的效价；图7:Fertilin Beta 抗体特异性的 Western blot 分析；图8:免疫荧光分析Fertilin Beta蛋白在精子细胞上的定位；具体实施方式:实施例1:抗GST-Fertilin Beta血清的在制备1.PCR-PMD18-T/Fertilin Beta 重组质粒的构建Fertilin Beta 基因全长从 Genebank 得到，基因序列号为 GenBank:AAC51110.1。以基因组为模板，上游引物为5’ -GAA TTC GAA GCA ATT CAT TTC AGT (含EcoRI酶切位点);下游:5,-CTC GAG ATT GTG AAG ACA CTG GGA (含 XhoI 酶切位点)。应用 PCR 成功扩增出了 Fertilin Beta基因胞外段314-373位氨基酸对应DNA序列长度99b本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用GST表达体系制备的Fertilin?Beta蛋白胞外段高效价抗体，其特征在于利用GST表达体系以Fertilin?Beta蛋白胞外段341?373位氨基酸对应DNA片段作为特异序列制备的GST?Fertilin?Beta融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST?FertilinBeta抗体的滴度高达1∶1000000，并经过Western?blot鉴定该Fertilin?Beta抗体具有较好的特异性，其中，341?373位氨基酸序列为：Glu?Ala?Ile?His?Phe?Ser?Gly?Val?Lys?Ile?Phe?Ser?Asn?Cys?Ser1???????????????????6???????????????????11Phe?Glu?Asp?Phe?Ala?His?Phe?Ile?Ser?Lys?Gln?Lys?Ser?Gln?Cys16??????????????????21??????????????????26Leu?His?Asn31其对应核苷酸序列为：gaagcaattc?atttcagtgg?tgtgaagatc?tttagtaact?gcagcttcga?agactttgca?60cattttattt?caaagcagaa?gtcccagtgtcttcacaat?99。...

【技术特征摘要】
1.利用GST表达体系制备的FertilinBeta蛋白胞外段高效价抗体,其特征在于利用GST表达体系以Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸对应DNA片段作为特异序列制备的GST-Fertilin Beta融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-FertilinBeta 抗体的滴度高达1: 1000000,并经过 Western blot 鉴定该 FertilinBeta抗体具有较好的特异性，其中，341-373位氨基酸序列为:Glu Ala He His Phe Ser Gly Val Lys He Phe Ser Asn Cys SerI611Phe Glu Asp Phe Ala His Phe He Ser Lys Gln Lys Ser Gln Cys16 21 26Leu His Asn31 其对应核苷酸序列为:gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca 60cattttattt caaagcagaa gtcccagtgtcttcacaat 99。2.如权利要求1所述的原核表达GST-FertilinBeta融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-Fertilin Beta融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-FertilinBeta抗血清,具体包括四步: 第一步，PCR-PMD18-T/Fertilin Beta重组质粒的构建 Fertilin Beta基因全长从Genebank得到，基因序列号为AAC51110.1，以基因组为模板,上游引物为 5’-GM TTC GAA GCA ATT CAT TTC AGT (含EcoRI 酶切位点);下游:5，_CTCGAG ATT GTG AAG ACA C TG GGA (含XhoI酶切位点)，扩增得到的片段与pMD18_T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5 α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI和SalI单酶切鉴定； 第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建 将含有Fertilin Beta基因胞外段341-373氨基酸片段的pMD18_T质粒经EcoRI和XhoI双酶切后，利用回收试剂盒获得Fertilin Beta基因该区片段，同时用相同的酶处理质粒PGEX-4T-1，然后将回收的Fertilin Beta基因胞外段341-373氨基酸片段和经酶切的载体PGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定； 第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的诱导表达和纯化 重组质粒PGEX-4T-1/Fer...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓萌，杨百全，赵兵，伍贤军，缪璇，汪小莞，许莹，李江，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：