一种鱼腥草水提液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物制药技术领域。具体涉及一种鱼腥草水提液及其制备方法和应用。本发明专利技术从鱼腥草水提液中获得的总多糖具有直接灭活或抑制手足口病病毒即肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇A16（CVA16）复制的活性;且进一步发现抗病毒活性的多糖主要为分子量大于100kDa的多糖。因此，该多糖可以在制备抗手足口病病毒药物中得到应用。作为一种可食用的水生草本植物鱼腥草来源广泛，毒副作用小，价格低廉，提取工艺简单等特点，具有重大的开发和应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种鱼腥草水提液及其制备方法和应用。
技术介绍
鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb)是三白草科蕺菜属多年生的草本植物。广泛分布于我国中部、东南及西南各省区。鱼腥草营养价值很高，是常用的野生蔬菜之一。同时具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋的功效，属于卫生部确定的既是药品又是食品的植物资源。鱼腥草化学成分主要包括挥发油、生物碱、黄酮类、有机酸、多糖等成分。其中挥发油主要成分为癸酰乙醛(鱼腥草素)，月桂醛等。生物碱的成分主要有吡啶类生物碱等。黄酮类物质包括槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、金丝桃苷、芦丁等成分。另外，水溶性多糖由葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等组成。目前国内外对鱼腥草的活性研究主要集中在挥发油和黄酮类化合物上，而对于鱼腥草水溶性成分特别是水溶性多糖成分的生物活性研究较少，对于鱼腥草中多糖类成分抗手足口病病毒 活性的研究国内外未见报道。手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)是亚太地区近几年来爆发的严重威胁儿童健康的一种传染病，主要感染0-5岁婴幼儿。临床上主要症状包括，手、脚、口唇等黏膜出现水泡性疹子并溃疡；重症患者伴有脑膜炎、脑炎、肺水肿、肺出血等甚至死亡。手足口病自2008年在中国阜阳爆发被卫生部列入丙类传染病以来，手足口病发病率和死亡率一直占丙类传染病首位。另外，临床上还没有针对手足口病病毒的有效疫苗和药物，手足口疾病形势极其严峻，开发研究防治手足口病病毒的疫苗和药物迫在眉睫。肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)和柯萨奇 A16 (Coxsackievirus A16, CVA16)是导致手足口病的两个主要病原体，属于无包膜的，小RNA肠道病毒。植物特别是可食用的传统中草药，具有来源丰富，价格低廉、安全低毒等特点，因此，开发利用植物资源，分离鉴定抗病毒活性成分，开发抗病毒药物研究具有巨大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是提供一种鱼腥草水提液及其制备方法和在防治手足口病病毒药物中的应用。本专利技术对鱼腥草水提液及水提液中的总多糖进行提取、分离以及抗手足口病病毒活性分别进行了鉴定，确定抗病毒多糖主要为分子量大于IOOkDa的多糖。因此，可开发制备成一种防治手足口病病毒药物。本专利技术所述的鱼腥草水提液和总多糖的制备方法具体为，鱼腥草干叶用去离子水洗净，烘干，按照植物质量和液体体积比为1:10(g/ml)加入去离子水，60° C到90° C水浴保温2-5小时，1000g/min离心IOmin获得滤液，滤渣按同样方法浸提2次,合并滤液。滤液经过5000g/min离心IOmin, 0.45 μ m滤膜过滤,去除杂质,冷冻干燥。水提液中总多糖的提取采用醇沉的方法进行沉淀。具体为，水提液中加入4倍体积的无水乙醇沉淀多糖，于4° C冰箱沉淀过夜，絮状沉淀用5000g/min离心20min，保留沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤3次后，真空干燥得到干燥的鱼腥草总多糖。采用硫酸苯酚法对多糖含量进行检测。将所得到的水提液和多糖进行体外抗病毒活性检测，发现，水提液和总多糖具有显著地抑制手足口病病毒EV71和CVA16感染的活性，进一步实验表明，活性多糖可以直接灭活EV71病毒颗粒，导致病毒失活无法进一步感染；而活性多糖可以抑制CVA16病毒在宿主细胞内的复制从而抑制其进一步的感染。通过超滤膜超滤离心，分子量大于IOOkDa的多糖组分被浓缩且抗病毒活性显著提高。相反，分子量小于IOOkDa的多糖组分抗病毒活性显著下降。说明鱼腥草多糖中抗病毒活性成分为分子量大于IOOkDa的多糖。本专利技术的优点在于:1.鱼腥草水提液和其中的水溶性多糖具有直接灭活EV71和抑制CVA16复制的特点，可以通过外用手段直接阻断传染源，灭活病毒感染，保护易感人群。2.鱼腥草水提液及多糖提取工艺简单、方便。鱼腥草中抗病毒多糖组分进一步得到鉴定，为分子量大于IOOkDa的活性多糖。3.鱼腥草水提液或总多糖可以单独或与其他药物组分配伍，制备为水剂、颗粒剂、胶囊等作为防治手足口病的药物。4.鱼腥草来源广泛，为可食用的传统中草药，安全低毒。附图说明图1.鱼腥草多糖抑制病毒感染时间曲线 ■ 一代表终浓度为30 μ g/ml的多糖抑制肠道病毒71型(EV71)的时间曲线；■■■■■代表终浓度为30 μ g/ml的多糖抑制柯萨奇A16 (CVA16)病毒的时间曲线；~ 代表感染病毒的时间点；一代表加入多糖的时间点。图2.鱼腥草多糖直接孵育病毒对病毒感染性颗粒释放的影响 ■代表未处理的病毒组 [3代表去离子水直接孵育的病毒组 H代表终浓度为30 μ g/ml的鱼腥草多糖直接孵育的病毒组图3.超滤离心所得各部分多糖的回收率具体实施例方式下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。非洲绿猴肾细胞VeiO细胞购于上海中科院细胞库。柯萨奇A16 (CVA16)和肠道病毒71型(EV71)标准株BrCr株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，肠道病毒71型阜阳株从江苏省疾控中心获得标准株。实施例一鱼腥草水提液和多糖的提取和检测 (一)鱼腥草水提液和多糖的提取 首先将鱼腥草干植物洗净，低温烘干至恒重，等分为两份，一份用于水提液的提取，另一份用于提取鱼腥草多糖。按照植物质量和液体体积比1:10 (g/ml)加入去离子水，于60° C到90° C水浴保温2-5小时，1000g/min离心IOmin获得上清水提液，沉淀滤渣按同样的方法浸提2次之后，合并滤液,上清用5000g/min离心IOmin, 0.45 μ m的滤膜进行过滤。上清液体直接冷冻冻干得到鱼腥草的水提液冻干粉，或上清水提液加入4倍体积的无水乙醇用于沉淀多糖，于4° C冰箱中静置过夜，有大量的絮状沉淀物析出，用5000g/min离心20min，获取沉淀物。沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤3次之后，真空干燥得到干燥的鱼腥草总多糖。(二)鱼腥草多糖含量检测 按上述方法提取所得的干燥的鱼腥草多糖，称重并计算沉淀物得率为2.48%-2.75%，计算方法为:得率％=(沉淀物质量/原植物质量)X 100%。沉淀用去离子水复溶之后，以葡萄糖为标准品，用硫酸苯酚法测定醇沉淀中鱼腥草多糖的含量为75.3%-83.1%，多糖含量计算方法为:多糖含量％= (CXVXN/ff) X 100%，其中C为多糖浓度，V为液体体积，N为稀释倍数，W为沉淀质量。实施例二鱼腥草水提液和多糖抗手足口病病毒活性检测 (一)鱼腥草水提液和鱼腥草多糖对细胞的毒性测试 于96孔板中培养Vero细胞，待细胞长成单层后，将上述所得水提液冻干粉和醇沉多糖用去离子水复溶后，用终浓度分别为I U g/ml、3 μ g/ml、10 μ g/ml>30 μ g/ml、100 μ g/ml、300 μ g/ml、1000 μ g/ml的样品处理Vero细胞，设置三个复孔。同时设置无药物处理的正常对照组。于37° C、5%C02培养箱中培养观察样品对Vero细胞的毒性，培养72小时之后，采用经典的检测细胞活力的MTT方法测定样品对VeiO细胞的毒性。具体来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼腥草水提液，其特征是由鱼腥草干植物，用60?C到90?C水浴法浸提2?5小时而得到。

【技术特征摘要】
1.一种鱼腥草水提液，其特征是由鱼腥草干植物，用60 C到90 C水浴法浸提2-5小时而得到。2.根据权利要求1所述的鱼腥草水提液的制备方法，其特征是由以下步骤获得: (0.称取鱼腥草干植物，用去离子水洗净，低温烘干至恒重； (2)按照干植物质量和液体体积比为1:10(g/ml)加入去离子水，用60 C-90 C水浴法浸提2-5小时； (3).通过1000g/min离心IOmin,获得上清,滤洛按步骤(2)浸提2次,合并滤液；(4)滤液经过5000g/min离心IOmin后,0.45 μ m滤膜过滤,去除杂质，冷冻干燥。3.根据权利要求1所述的鱼腥草水提液在制备抗病毒药物中的应用。4.根据权利要求1所 述的鱼腥草水提液在制备治疗手足口病病毒药物中的应用。5.根据权利要求1所述的鱼腥草水...

【专利技术属性】
技术研发人员：李尔广，陈晓庆，王伟，金玉，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：