基于化学发光法检测蛋白酶活性及其抑制剂活性的方法，涉及生物分析化学技术领域，解决了现有检测酶活性的方法存在的流路设计复杂、操作繁琐、检测灵敏度低和成本高的问题。基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法为：步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；步骤二、向步骤一中的血红素蛋白溶液中加入不同浓度的蛋白酶，形成反应体系；步骤三、将步骤二中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶活性进行检测。本发明专利技术的方法具有简便、快捷、高灵敏、低成本的优点，能够得到更低的检出限，对胰蛋白酶检出限可以达到1ng/mL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物分析化学
，具体涉及一种。
技术介绍
流动注射分析技术是自20世纪80年代发展起来的一种新型试样分析技术，它利用蠕动泵驱动试剂和试样，当试剂和试样混合之后流经检测器时信号被检测，基本的流路系统如图1所示。流动注射分析技术具有广泛的适用性，可以与多种检测手段联用，可用于进样、在线样品处理、自动监测以及过程分析等；具有效率高的优点，其采样频率可以达到40 300/h ;试样消耗量低，一般消耗10 100 UL ;设备简单，价廉。化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，其发光机理是反应体系中的某些物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁至激发态，从激发态返回基态时将能量以光辐射的形式释放出来，产生发光现象。化学发光分析法则是依据某一时刻化学发光强度或化学发光总量来确定反应中相应组分含量的一种微量及痕量分析法，具有高灵敏度、线性范围宽、设备简单、操作简便、易于实现自动化和分析快速等特点。近年来，与流动注射、电化学、高效液相色谱和毛细管电泳等方法的联用，使得化学发光分析法已广泛应用于药物分析、临床分析、环境分析和材料分析等领域。流动注射化学发光法结合了流动注射分析法与化学发光法各自的优点，能够进行快速的测定和高通量的分析，同时又能够高灵敏度的分析。蛋白酶是一类能够水解蛋白质中肽键的一类酶的总称，这些蛋白酶多数都是蛋白质，在人体内有超过550种蛋白酶，这些蛋白酶大约占人体内所有蛋白种类的2%左右。蛋白酶在生物体内有着十分重要的作用，在蛋白质的消化转移、血液的凝结、生长发育以及细胞信号传导。蛋白酶的功能紊乱与许多人类重大疾病如癌症、阿尔茨海默病、糖尿病等有重要的关系，因此对于蛋白酶活性的检测有着重要的意义，开发新型的灵敏检测蛋白酶活性的方法是势在必行的。目前，酶活性的检测方法主要有毛细管等电聚焦，凝胶电泳，高效液相色谱法，酶联接免疫吸附剂测定电化学方法等多种方法。基于化学发光法的酶活性检测方法见于报道的很少。1995 年，Alan Townshend (Robert Edwards, Alan Townshend, Barry Stoddart.Analyst, 1995，120 :117-120.)等人通过合成一种三肽-异鲁米诺衍生物，如图2所示，将此衍生物固定于一种固体支持物上，在加入蛋白酶之后，蛋白酶将固定于固体支持物上的三肽-异鲁米诺衍生物中的肽键切断，从而使得异鲁米诺脱离于固体支持物，异鲁米诺随着载流进入流动注射化学发光系统，在先后与钴离子和过氧化氢混合之后，钴离子能够极大的催化异鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应，通过化学发光的强度进行蛋白酶的检测。这种方法对胰蛋白酶的检出限达到了 40ng/mL，但是此方法需要合成特定的三肽-异鲁米诺衍生物，流路设计复杂，操作较为繁琐，检测灵敏度低，成本高。
技术实现思路
为了解决现有检测酶活性的方法存在的流路设计复杂、操作繁琐、检测灵敏度低和成本高的问题，本专利技术提供一种简便、快捷、高灵敏、低成本的。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下本专利技术提供的一种基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，该方法的条件和步骤如下步骤一、将血红素蛋白溶解于TriS-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；步骤二、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35 40°C水浴中温育3 lOmin，然后再向血红素蛋白溶液中加入不同浓度的蛋白酶，形成反应体系；步骤三、将步骤二中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶活性进行检测。所述蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胶原蛋白酶。所述血红素蛋白为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。所述反应体系包括以下① ④中的任意一种①终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0 200ng/ml的胰蛋白酶、蛋白酶K或胰凝乳蛋白酶，浓度为50 mM pH为8. 2的Tris-HCl缓冲溶液；②终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0 1000ng/ml的木瓜蛋白酶或胶原蛋白酶，浓度为50 mM pH为8. 2的Tris-HCl缓冲溶液；③终浓度为200nM的血红蛋白，浓度为0 40 y g/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mMpH为8. 2的Tris-HCl缓冲溶液；④终浓度为200nM的辣根过氧化物酶，浓度为0 40 y g/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mM pH为8. 2的Tris-HCl缓冲溶液。所述鲁米诺-过氧化氢检测体系包括pH为9. 0浓度为I X 10_4 M的鲁米诺溶液，浓度为1X10_3 M的过氧化氢水溶液。本专利技术还提供一种基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，该方法的条件和步骤如下步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；步骤二、将蛋白酶与不同浓度的蛋白酶抑制剂混合均匀，得到混合溶液；步骤三、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35 40°C水浴中温育3 lOmin，然后再将步骤二中的混合溶液中加入到血红素蛋白溶液中，形成反应体系；步骤四、将步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶抑制剂活性进行检测。所述蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂、蛋白酶K抑制剂、木瓜蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂或胶原蛋白酶抑制剂。所述血红素蛋白为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。所述反应体系包括以下① ⑦中的任意一种①浓度为200ng/mL的胰蛋白酶，浓度为0 100ng/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C ；②浓度为200ng/mL的蛋白酶K，浓度为0 280iig/ml的蛋白酶K抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C ；③浓度为I ii g/ml的木瓜蛋白酶,浓度为0 400ng/ml的木瓜蛋白酶抑制剂,终浓度为50nM的细胞色素C ；④浓度为200ng/mL的胰凝乳蛋白酶,浓度为0 160ng/ml的胰凝乳蛋白酶抑制齐U，终浓度为50nM的细胞色素C ；⑤浓度为Iy g/ml的胶原蛋白酶,浓度为0 54 ii g/ml的胶原蛋白酶抑制剂,终浓度为50nM的细胞色素C ；⑥浓度为40 ii g/ml的胰蛋白酶,浓度为0 120li g/ml的胰蛋白酶抑制剂,终浓度为200nM的血红蛋白；⑦浓度为40 ii g/ml的胰蛋白酶,浓度为0 120li g/ml的胰蛋白酶抑制剂,终浓度为200nM的辣根过氧化物酶。所述鲁米诺-过氧化氢检测体系包括pH为9. 0浓度为I X 10_4 M的鲁米诺溶液，浓度为1X10_3 M的过氧化氢水溶液。专利技术原理本方法采用一种天然的蛋白质即细胞色素C为酶切底物，细胞色素C在天然的状态下几乎不能够催化鲁米诺-过氧化氢的化学发光反应，而在蛋白酶水解后，细胞色素C中的血红素脱离出来，以单体形式存在的血红素能够强烈的催化鲁米诺-过氧化氢的化学发光反应。在细胞色素C溶液中，随着加入的蛋白酶的量的增加，水解产生的血红素的量增多，从而产生化学发光信号值增强，在一定的反应时间内，发光信号强度值与加入的蛋白酶的量成正比，进而检测蛋白酶活性。蛋白酶抑制剂的加入能够有效的抑制蛋白酶的活性，随着加入的蛋白酶抑制剂的量的增多，蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的效率增高，蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris?HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；步骤二、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35～40℃水浴中温育3～10min，然后再向血红素蛋白溶液中加入不同浓度的蛋白酶，形成反应体系；步骤三、将步骤二中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺?过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶活性进行检测。
【技术特征摘要】
1.基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下 步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液； 步骤二、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35 40°C水浴中温育3 lOmin，然后再向血红素蛋白溶液中加入不同浓度的蛋白酶，形成反应体系； 步骤三、将步骤二中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶活性进行检测。2.根据权利要求1所述的基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胶原蛋白酶。3.根据权利要求1所述的基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述血红素蛋白为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。4.根据权利要求1所述的基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述反应体系包括以下① ④中的任意一种 ①终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0 200ng/ml的胰蛋白酶、蛋白酶K或胰凝乳蛋白酶，浓度为50 mM pH为8. 2的Tris-HCl缓冲溶液； ②终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0 1000ng/ml的木瓜蛋白酶或胶原蛋白酶，浓度为50 mM pH为8. 2的Tris-HCl缓冲溶液； ③终浓度为200nM的血红蛋白，浓度为0 40ii g/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mM pH为.8. 2的Tris-HCl缓冲溶液； ④终浓度为200nM的辣根过氧化物酶，浓度为0 40ii g/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mMpH为8. 2的Tris-HCl缓冲溶液。5.根据权利要求1所述的基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述鲁米诺-过氧化氢检测体系包括pH为9. 0浓度为I X 10_4 M的鲁米诺溶液，浓度为I X 10_3M的过氧化氢水溶液。6.基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下 步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液； 步骤二、将蛋白酶与不同浓度的蛋白酶抑制剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：于聪，张青峰，李文英，陈健，王方远，王燕，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：
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