一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法技术

本发明专利技术公开了一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法，采用栉孔扇贝担轮幼虫专用无钙海水等渗缓冲液浸泡与机械法结合的方式实现了对栉孔扇贝担轮幼虫细胞的完全解离，无需经任何酶类的消化。使用密度梯度离心的方法实现了三种类型担轮幼虫体外培养细胞的分离，分离后的细胞能够在栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中保持良好活力，并实现传代培养。该方法对栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的损伤小，成本低效率高，具有可重复性，本发明专利技术建立了一种高效的海洋贝类细胞解离和分离的方法，能够实现解离和分离后细胞的传代培养，对海洋贝类细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立具有重要的指导意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养
，尤其涉及。
技术介绍
截至目前国内外尚无人建立海洋双壳类细胞的体外培养体系，将范围扩展至软体动物门类，目前仅有一个来自淡水蜗牛(Bromphalaria glabrat)胚胎细胞的永久细胞系成功建立。细胞的取材体外培养的细胞多取材于动物胚胎、成年动物组织、人体手术活体材料，幼虫细胞是兼具胚胎细胞和幼虫期特有细胞性质的高分裂能力的细胞，是一类具有体外培养前景的细胞来源。奸夷扇贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献Primary cell culturefromembryos of the Japanese seallop Mizuchopecten yessoensis (Bivalvia)(199ICytotechnology)。贻贝面盘幼虫细胞的体外培养(备注面盘幼虫是担轮幼虫下一个发育阶段)° 参考文献Isolation and partial characterization of myogenic cells frommussellarvae in vitro(2000Tissue Cell)。紫贻贝担轮幼虫 细胞的体外培养。参考文献Comparative CharacteristicofMytilus Muscle Cells Developed In Vitro and In Vivo. (2003 Journal ofExperimentalZoology)。紫贻贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献Muscle andneuronaldifferentiation in primary cell culture of larval Mytilustrossulus(Mollusca Bivalvia) (2010 Cell Tissue Research)。幼虫细胞的解离方式上述幼虫细胞均采用无钙水浸泡后再经0. 25%或0. 125%胶原酶解离的方式获得单个的细胞。幼虫细胞的除菌方法在虾夷扇贝幼虫细胞体外培养中，在经紫外线消毒的海水中添加500单位/晕升青霉素和40微克/晕升庆大霉素作为培养幼虫的消毒海水，并且在细胞培养基中添加了 40微克/毫升庆大霉素；在紫贻贝幼虫细胞体外培养中，使用Percoll密度梯度离心法除去细菌。细胞传代方式目前尚无关于幼虫细胞传代方法的报道，传代培养的核心工作有两方面，一是分割培养物，二是再次接种。把贴壁依赖型细胞从培养基质上解离下来的方法主要有1).胰蛋白酶溶液消化；2).对于贴壁不牢的细胞可采用机械的振荡法。幼虫培养基的优化虾夷扇贝担轮幼虫细胞L15基础培养基；25微克/毫升牛磺酸，50微克/毫升葡萄糖，100微克/毫升谷氨酰胺，2%胎牛血清，40微克/毫升庆大霉素。紫贻贝担轮幼虫细胞L_15基础培养基；2%胎牛血清，胰岛素(50微克/毫升)，维生素E(l. 75微克/晕升)。现有技术的缺点是在细胞培养过程中，经酶类解离后的细胞损伤较大，细胞寿命有限，无法实现贝类细胞的传代培养，同时细胞培养体系中的细胞种类复杂，不利于对其细胞生物学的确切描述与深入研究。
技术实现思路
本专利技术提供了，旨在解决现有技术无法实现体外培养的贝类细胞传代培养的问题以及分离纯化问题。本专利技术的目的在于提供一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞的解离方法和体外培养细胞的分离方法，该细胞解离以及分离方法包括以下步骤步骤一，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛絹上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；步骤二，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；步骤三，使用不同浓度的Percoll细胞分离液通过密度梯度离心的方法将刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞分离为三大类别；步骤四，当分离后的三类栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。进一步，在步骤二中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌且过滤的海水等渗磷酸盐缓冲溶液。 进一步，在步骤二中，机械解离法的实现方法为手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器，并用移液管反复吹打含有栉孔扇贝担轮幼虫的液体I分钟以上，以1000转/分钟的速度离心5分钟后，收集得到解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞。进一步，在步骤三中，密度梯度离心的实现方法为所配制的Percoll细胞分离液的浓度为10%，15%，25%，35% ;离心条件为1500g离心力，时间20分钟。进一步，在步骤三中，将细胞分离为三大类别的实现方法为第一步密度梯度离心，使用25% Percoll细胞分离液与35% Percoll细胞分离液，担轮幼虫细胞经离心后被分离为处于25% Percoll液段上层的A群细胞以及处于该液段底层的具黑色颗粒的B群细胞；第二步密度梯度离心，A群细胞经栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液冲洗，使用10% Percoll细胞分离液与15% Percoll细胞分离液，A群细胞经离心后被分离为处于10% Percoll液段上层的直径小且胞质暗的Al群细胞以及处于15% Percoll液段胞质透亮的A2群细胞。分离后的3类细胞具有各自独特的生物学特征，且在栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中能够实现传代培养。本专利技术提供的高效和节约的海洋贝类细胞解离和分离的方法，解离和分离后的细胞能够实现体外增殖和传代培养，是首个海洋贝类的连续细胞系，对除栉孔扇贝之外的其他贝类细胞的解离、分离以及细胞系的建立具有重要的指导意义。附图说明图1是本专利技术实施例提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法的实现流程图。图2是本专利技术实施例提供的分离方法的具体实施方案的流程图。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定专利技术。图1示出了本专利技术实施例提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离方法的实现流程。一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞的解离方法和体外培养细胞的分离方法，该细胞解离以及分离方法包括以下步骤步骤S101，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛絹上流水冲洗半小时以上，去除表面的微 生物；步骤S102，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；步骤S103，使用不同浓度的Percoll细胞分离液通过密度梯度离心的方法将刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞分离为三大类别；步骤S104，当分离后的三类栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。在步骤S102中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌且过滤的海水等渗磷酸盐缓冲溶液。在步骤S102中，机械解离法的实现方法为手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器，并用移本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法，其特征在于，细胞解离以及分离方法包括以下步骤：步骤一，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；步骤二，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；步骤三，使用不同浓度的Percoll细胞分离液通过密度梯度离心的方法将刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞分离为三大类别；步骤四，当分离后的三类栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。

【技术特征摘要】
1.一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法，其特征在于，细胞解离以及分离方法包括以下步骤 步骤一，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛絹上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物； 步骤二，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞； 步骤三，使用不同浓度的Percoll细胞分离液通过密度梯度离心的方法将刚刚解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞或体外培养一段时间的栉孔扇贝担轮幼虫细胞分离为三大类别； 步骤四，当分离后的三类栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在步骤二中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌且过滤的海水等渗磷酸盐缓冲溶液。3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在步骤二中，机械解离法的实现方法为手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器，并用移液管反复吹打含有栉孔扇贝担轮幼...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏萌，张志峰，季爱昌，毕颖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：