高效活性复合腐败脱色菌剂的制备方法技术

本发明专利技术是利用肉汤培养基腐败发酵后，倒入细菌染色废水进行驯化培养，分离筛选出了三株脱色菌，根据观察到的三株脱色菌的形态特征和培养特征以及所做的生化实验，最终确定为一株蜡样芽孢杆菌、一株产气荚膜梭菌和一株腐败希瓦氏菌。将低温保存的三株脱色菌分别接种到斜面营养琼脂培养基上进行复壮培养，将复壮的三株脱色菌复合在肉汤培养基中培养，获得种子液，将种子液接种到装有肉汤培养基的发酵罐中扩大发酵培养，制成了一种高效活性复合腐败脱色菌剂。本发明专利技术的高效活性复合腐败脱色菌剂的制备过程简单，性能稳定，使用方便，可常温下储存而不失活性，对细菌染色废水的脱色率达到100％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供，属于微生物制剂
技术背景目前，许多国家和地区研制了多种多样的高效微生物菌剂，制成商品出售。建立环境微生物制剂微生物菌种库，是促进其产业化发展的基础，以符合实际的需求。本专利技术是微生物工程在环保领域的应用，特别是利用发酵技术生产的高效活性复合腐败脱色菌剂对微生物实验室每年产生的大量细菌染色废水进行脱色处理，这些废水中主要染料是碱性染料，它们结构复杂，难以降解，具有潜在毒性，若直接排放不仅对环境造成严重污染，也间接影响人们的身体健康。微生物法处理染色废水不仅价廉，而且无二次污染，符合可持续发展的需要。本专利技术的高效活性复合腐败脱色菌剂由一株蜡样芽孢杆菌、一株产气荚膜梭菌和一株腐败希瓦氏菌三株脱色菌共同存在的复合脱色菌剂，这三株脱色菌都属于食物腐败菌。蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌和腐败希瓦氏菌在自然界分布广泛，常存在于空气、尘埃、 土壤、水、植物及动物活动环境中。高效活性复合腐败脱色菌剂可常温下储存而不失活性， 在一定条件就可恢复自然状态并具有正常三株脱色菌活性的细胞，并具有性能稳定，使用方便等优点。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对细菌染色废水中污染物种类繁多，结构复杂，难以降解，具有潜在毒性，直接排放对环境造成严重污染等缺点，专利技术一种，包括(I)将肉汤培养基倒入锥形瓶，瓶口塞上棉塞，置于恒温培养箱35°C腐败发酵48 小时，肉汤培养基浑浊并在表面形成乳白色菌膜，菌液略带香腐味；(2)将细菌染色废水倒入腐败肉汤培养基内，置于恒温培养箱35°C培养驯化直到染色废水完全脱色；(3)吸取驯化脱色菌液O.1mL,用肉汤培养液做10倍递减稀释，取O.1mL每个稀释度的菌液均勻涂布于营养琼脂培养基平板上，置于恒温培养箱35°C培养48小时,重复此步骤直至固体培养基上分离出边缘清晰的单个菌落，分别挑取不同形态的菌落，接种到肉汤培养基内培养，倒入细菌染色废水，观察脱色效果，最终筛选出三株脱色菌。根据观察到的三株脱色菌的形态特征和培养特征以及所做的生化实验，确定三株脱色菌为一株蜡样芽孢杆菌、一株产气荚膜梭菌和一株腐败希瓦氏菌；(4)斜面培养基复壮将低温保存的三株脱色菌分别接种到斜面营养琼脂培养基上，置于恒温培养箱35°C培养48小时；(5)种子液的制备将复壮的三株脱色菌分别以5%的接种量，接种复合到装有肉汤培养基的锥形瓶内，350C，IOOrpm振荡培养48小时，获得种子液；(6)扩大发酵培 养将种子液以5%的接种量，接种到装有肉汤培养基的发酵罐中，35°C，IOOrpm振荡培养48小时，至活菌数为I 8 X 109cfu/mL，放罐，喷干，获得高效活性复合腐败脱色菌粉。所述步骤⑴中的肉汤培养基的配方牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、 蒸懼水 lOOOmL、pH = 7. 2。所述步骤(3)中的10倍递减稀释度为10—1 10,。所述步骤(3)中的营养琼脂培养基的配方牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠 5g/L、琼脂 20g/L、蒸馏水 lOOOmL, pH = 7. 2。本专利技术具备的优点高效活性复合腐败脱色菌剂的制备过程简单，性能稳定，使用方便，可常温下储存而不失活性，在一定条件就可恢复自然状态并具有正常三株脱色菌活性的细胞，可应用于细菌染色废水的脱色，脱色率达到100%。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1一次偶然发现将配制好的肉汤培养基倒入锥形瓶，瓶口塞上棉塞，煮至沸腾，放在室温下(夏天)，两天后瓶内液体培养基呈现混浊，其表面形成乳白色菌膜，倒入细菌染色废水，48小时后染料颜色完全脱去，说明肉汤培养基自然腐败具有很好的脱色功能，于是有了以下的实验过程1.三株脱色菌的驯化及筛选，包括(I)将装有肉汤培养基的锥形瓶，瓶口塞上棉塞，置于恒温培养箱35°C腐败发酵 48小时，肉汤培养基浑浊并在表面形成乳白色菌膜，菌液略带香腐味，所用肉汤培养基的配方为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、蒸馏水IOOOmUpH = 7. 2 ；(2)将细菌染色废水倒入腐败肉汤培养基内，置于恒温培养箱35°C培养驯化直到染色废水完全脱色；(3)吸取驯化脱色菌液0. lmL，用肉汤培养液做10倍递减稀释，使菌液稀释度从 IO-1至10_1(1，取0.1mL每个稀释度的菌液均匀涂布于营养琼脂培养基平板上，置于恒温培养箱35°C培养48小时，重复此步骤直至固体培养基上分离出边缘清晰的单个菌落，分别挑取不同形态的菌落，接种到肉汤培养基内培养，倒入细菌染色废水，观察脱色效果，最终筛选出三株脱色菌。根据观察到的三株脱色菌的形态特征和培养特征以及所做的生化实验，确定三株脱色菌为一株腊样芽孢杆菌、一株产气荚膜梭菌和一株腐败希瓦氏菌(以前称腐败假单胞菌)，所用营养琼脂培养基的配方为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂 20g/L、蒸馏水 IOOOmUp H = 7. 2。2.三株脱色菌的生物学特性对三株脱色菌进行多种染色后镜检及在半固体营养培养基上穿刺培养，确定① 一株蜡样芽孢杆菌的形态特征为革兰氏阳性大杆菌，菌体两端钝圆，成短链但较长，无荚膜，有运动性，芽胞位于菌体中央呈椭圆形，芽胞不突出菌体；②一株产气荚膜梭菌的形态特征为革兰氏阳性芽胞短杆菌，单在或成双，无鞭毛，不运动，培养时芽孢少见，因在肉汤无糖培养基中培养生成了芽孢，芽孢位于菌体次端呈椭圆形,使菌体膨账,整个菌体呈蝌蚪状颓变形态；③一株腐败希瓦氏菌的形态特征为革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，多单在， 无荚膜，无芽孢，极毛运动。通过观察到的三株脱色菌在营养琼脂培养基上和肉汤培养基内的生长状态及所做的相关实验，确定①一株蜡样芽孢杆菌的培养特征兼性厌氧，在营养琼脂培养基上生长菌落为白色扁平的圆形中央微隆起一个乳白小圆点，表面较光滑湿润，质地软，不透明， 边缘稍不整齐，直径3 5毫米，能使肉汤培养基浑浊并在表面形成乳白色菌膜，振摇易破碎成小块，菌液略带香腐味；②一株产气荚膜梭菌的培养特征厌氧但不严格，耐氧，在微需氧的环境也能生长，在营养琼脂培养基上生长菌落为圆形，白色，凸起，表面光滑湿润，半透明，边缘整齐，直径I 2毫米，能使肉汤培养基混浊并在表面形成一层薄的乳白色菌膜， 振摇易乳化，菌液略带香腐味；③一株腐败希瓦氏菌的培养特征兼性厌氧，在营养琼脂培养基上生长菌落为圆形，白色，稍凸起，表面光滑湿润有光泽，透明，边缘较整齐，直径2 3 毫米，能使肉汤培养基浑浊并在表面形成乳白色菌膜，振摇易乳化，菌液略带香腐味。根据三株脱色菌在不同温度的肉汤培养基中的生长状态，确定①一株蜡样芽孢杆菌的生长温度范围在10 50°C之间；②一株产气荚膜梭菌的生长温度范围在4 60°C 之间；③一株腐败希瓦氏菌的生长温度范围在2 37°C之间。对三株脱色菌进行生化实验，确定①一株蜡样芽孢杆菌的生化特性动力阳性， 触酶阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨酸、果糖和糊精等，能液化明胶、胨化牛乳，溶血阳性，不分解甘露醇，v-ρ、枸櫞酸盐、DNA酶和硝酸盐还原试验均为阳性，吲哚、脲酶、硫化氢和甲基红试验阴性；②一株产气荚膜梭菌的生化特性能分解多种常见的糖类，如葡萄糖、 麦芽糖、蔗糖和乳糖，产酸产气，不发酵甘露糖或水杨苷，能液化明胶，卵磷脂酶阳性，本文档来自技高网...

【技术保护点】
高效活性复合腐败脱色菌剂的制备方法，包括：(1)将肉汤培养基倒入锥形瓶，瓶口塞上棉塞，置于恒温培养箱35℃腐败发酵48小时，肉汤培养基浑浊并在表面形成乳白色菌膜，菌液略带香腐味；(2)将细菌染色废水倒入腐败肉汤培养基内，置于恒温培养箱35℃培养驯化直到染色废水完全脱色；(3)吸取驯化脱色菌液0.1mL，用肉汤培养液做10倍递减稀释，取0.1mL每个稀释度的菌液均匀涂布于营养琼脂培养基平板上，置于恒温培养箱35℃培养48小时，重复此步骤直至固体培养基上分离出边缘清晰的单个菌落，分别挑取不同形态的菌落，接种到肉汤培养基内培养，倒入细菌染色废水，观察脱色效果，最终筛选出三株脱色菌。根据观察到的三株脱色菌的形态特征和培养特征以及所做的生化实验，确定三株脱色菌为一株蜡样芽孢杆菌、一株产气荚膜梭菌和一株腐败希瓦氏菌；(4)斜面培养基复壮：将低温保存的三株脱色菌分别接种到斜面营养琼脂培养基上，置于恒温培养箱35℃培养48小时；(5)种子液的制备：将复壮的三株脱色菌分别以5％的接种量，接种复合到装有肉汤培养基的锥形瓶内，35℃，100rpm振荡培养48小时，获得种子液；(6)扩大发酵培养：将种子液以5％的接种量，接种到装有肉汤培养基的发酵罐中，35℃，100rpm振荡培养48小时，至活菌数为1～8×109cfu/mL，放罐，喷干，获得高效活性复合腐败脱色菌粉。...

【技术特征摘要】
1.高效活性复合腐败脱色菌剂的制备方法，包括(1)将肉汤培养基倒入锥形瓶,瓶口塞上棉塞,置于恒温培养箱35°C腐败发酵48小时， 肉汤培养基浑浊并在表面形成乳白色菌膜，菌液略带香腐味；(2)将细菌染色废水倒入腐败肉汤培养基内，置于恒温培养箱35°C培养驯化直到染色废水完全脱色；(3)吸取驯化脱色菌液O.lmL，用肉汤培养液做10倍递减稀释，取O.1mL每个稀释度的菌液均匀涂布于营养琼脂培养基平板上，置于恒温培养箱35°C培养48小时，重复此步骤直至固体培养基上分离出边缘清晰的单个菌落，分别挑取不同形态的菌落，接种到肉汤培养基内培养，倒入细菌染色废水，观察脱色效果，最终筛选出三株脱色菌。根据观察到的三株脱色菌的形态特征和培养特征以及所做的生化实验，确定三株脱色菌为一株蜡样芽孢杆菌、一株产气荚膜梭菌和一株腐败希瓦氏菌；(4)斜面培养基复壮将低温保存的三株脱色菌分别接种到斜面营养琼脂培养基上， 置于恒温培养箱35°C培养48小时；(5)种子液的制备将复...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓华，周键，王三反，张学敏，
申请(专利权)人：兰州交通大学，
类型：发明
国别省市：