口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法技术

本发明专利技术涉及口服降血糖重组人胰岛素原的产品及制备方法和应用，是利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与人胰岛素原基因重组，带有肠激酶标签，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示人胰岛素原的重组芽孢。本发明专利技术成功的筛选出重组枯草芽孢杆菌菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示有人胰岛素原。本发明专利技术的重组芽孢可直接用于动物口服进行肠道消化吸收，在保持了芽孢生理特性的基础上同时具有人胰岛素原的部分药效性和营养功能。同时，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及表面展示外源蛋白的重组芽孢的制备方法及产品，具体指的是在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示带有肠激酶标签的人胰岛素原HPI重组芽孢，属于重组融合蛋白药物

技术介绍
人胰岛素原(human proinsulin, HPI)是由109个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子量约为 12kD (Bell GI, et al. 1979. Kyriazis GA, et al. 2012)，等电点在5.2左右。HPI是人体唯一降血糖激素胰岛素的前体蛋白，体内和体外的研究均发现其能够有效降低胰高血糖素 刺激的糖原分解，并结合胰岛素受体发挥生物效应。人体内胰岛素水平的长期失衡容易引起糖尿病，随着人类社会的不断发展和人民生活水平的不断提高，糖尿病的患者人数也在不断上升，其中中国已经成为世界上糖尿病患者最多的国家，2008年的流行病学分析显示全国的总患病人数约为9200万人，它被认为是二十一世纪威胁人类健康的沉默杀手。治疗糖尿病患者的方法主要是胰岛素的静脉注射(胰岛素注射液，商品名为诺和灵，诺和诺德生物制药公司生产http://www. novonordisk. com ;胰岛素的注射药来得时，赛诺菲集团生产http://www. sanof1. cn/l/cn/zh/index, jsp),其给患者带来了极大的精神痛苦，也容易引起高胰岛素血症、体重增加和低血糖等并发症，并且糖尿病患者的治疗费用昂贵(美国每名糖尿病患者的年治疗费用达11744美元)，因此越来越多的研究开始专注于口服降血糖药物的开发，目前中国的上市公司通化东宝正在进行口服胰岛素胶囊的二期临床开发(通化金马 http://125. 35. 24. 210/cpi/jsp/preview_l. jsp TID=20080505093125243274372)，其胰岛素的成分主要是发酵重组胰岛素获得。胰岛素的生产早期主要是从动物的胰腺中纯化结晶获得的，到了二十世纪九十年代才开始了世界范围内的重组胰岛素制剂的研制，但是其生产工艺复杂且产量较低，很难满足目前市场上对胰岛素制剂的需求(每年大约有几百亿美元的市场价值)，其中胰岛素原的生产就是严重制约胰岛素制剂规模化的瓶颈。胰岛素原对肝代谢有较强的选择性作用，能够有效抑制肝葡萄糖的输出作用。利用胰岛素原的灌注实验发现其灭活时间远长于胰岛素，许多研究者认为可将其作为活性胰岛素来治疗糖尿病，临床实验也发现给2型糖尿病人注射胰岛素原，可控制空腹血糖含量，且很少发生低血糖。目前已有通过基因工程的方法用酵母发酵生产重组人胰岛素原，2010年德国亥姆霍兹中心感染研究所公布其毕赤酵母分泌发酵方法http://www.helmholtz-hz1.de/en/news_events/news/view/article/complete/new_pathway_to_cheapjnsulin/，但要实现药物级重组人胰岛素原的大规模生产，发酵法仍然有许多的缺点和不足，因为重组人胰岛素原产品对纯度要求极高，纯度要求达到99. 999999%以上，任何微量的杂蛋白都可能造成严重的免疫反应。这使得发酵法生产重组人胰岛素原的分离纯化方法和步骤复杂,生产成本较高。枯草芽孢杆菌为环境友好型细菌，对弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害细菌有很强的抑制作用，营养缺乏时能形成处于代谢休眠状态的芽孢，在适宜条件下芽孢又能萌发成具有繁殖能力的营养细胞，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶、糖化酶等促进消化吸收的物质。芽孢容易培养，比重大易分离、不需要复杂的分离纯化操作。芽孢是生物界中抗逆性最强的生命体，其稳定性好，能耐氧化，耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C 140°C还能生存几小时，并且在抗化学药物和抗辐射等方面也十分突出，可在恶劣环境中存活几年至几十年。芽孢在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，顺利通过动物消化道直达大小肠，可作为极端环境(如胃肠道)下异源蛋白或生物活性分子的载体(Oggioni MR, et al. 2003. Vaccine. 21:96-101)。枯草芽孢杆菌以孢子状态进入消化道后，迅速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气，并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌(大肠杆菌、沙门氏杆菌)的生长，因而能预防腹泻、下痢等肠胃道疾病，增强机体的免疫力和体质水平。目前市场上已经有口服枯草芽孢杆菌活菌胶囊产品，北京紫竹药业有限公司，国药准字 S20030018(http://www. 777aaa. com/html/yao/200791823402711963569029. htm)，表明枯草芽孢杆菌芽孢可以通过人口服使用而产生药效性。家蚕具有类似哺乳动物和人的脑、心脏、肝脏、肾脏、胃肠、神经、肌肉等类似器官和组织，对药剂的反应和对病原物的感受性与人相当一致。实践也证明用蚕作人类疾病研究和开发新医药的新的模式动物在第一阶段使用很好，试验快速、简便、成本低。同时家蚕作为药物初筛的模式动物还具有不逃逸，体外可以进行药物吸收性试验等优点，因此越来越多的研究开始用家蚕作为药物筛选的初级动物模型。家蚕和人同样具备调节血液中糖浓度即血糖值的功能，先前的实验显示过高的血糖浓度会使家蚕的生长发育受到抑制并且胰岛素可以降低家蚕血糖的含量，也就是说家蚕存在着与人体类似的血糖调节机制，本研究首次希望通过创建家蚕的糖尿病模型来筛选一些胰岛素类似物，同时为下面开发临床应用的膜岛素口服制剂提供实验基础。 本专利技术的目的在于根据人体胃肠道的消化特征，以益生菌枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白为载体，通过芽孢展示技术将带有肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的人胰岛素原展示在芽孢表面，使人胰岛素原获得快速大量表达具有良好抗逆性的同时能够在人体肠道进行增殖和自由消化吸收，适用于快速大量制备具有降血糖功效的重组人胰岛素原的口服药物。该产品结合了枯草芽孢杆菌的抗逆性特征和人体胃肠道的消化特点，增加了肠激酶位点，开发出能够在人体口服进行自由消化吸收的降血糖多肽药物，同时，能进行大规模的工业生产，迄今尚未见类似的报道和专利技术专利。本专利技术通过家蚕糖尿病模型进行降血糖药物的初级筛选。首次成功构建家蚕糖尿病模型的各项生理生化指标符合糖尿病模型的标准，通过人胰岛素原重组芽孢的糖尿病模型家蚕口添实验，证明了本产品的降血糖功效，这也是首例应用家蚕糖尿病模型成功进行降血糖药物筛选的产品。
技术实现思路
为了解决口服降血糖药物开发存在的问题，本专利技术提供了一种表面展示人胰岛素原HPI的重组芽孢的制备方法和产品。本专利技术以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC为载体，通过芽孢表面展示技术将带有肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的人胰岛素原展示在枯草芽孢杆菌的芽孢表面，可用于动物直接口服，成为一种新型的人胰岛素原降血糖药物，其在安全性、耐受性、药效学以及药代动力学等方面与胰岛素具有类似的功效。相对于其它注射型胰岛素产品，本专利技术表面展示人胰岛素原的制备方法主要用于口服易于吸收，同时具有工业化生产特点，具有更广泛的应用价值。这种产品的专利技术克服了当前人胰岛素来源于胰腺组织提取的限制，同时也克服本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，其特征在于：利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与人胰岛素原基因重组，带有肠激酶标签，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示人胰岛素原的重组芽孢。

【技术特征摘要】
1.一种口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，其特征在于利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与人胰岛素原基因重组，带有肠激酶标签，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示人胰岛素原的重组芽孢。2.按照权利要求1所述的口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因是CotC。3.按照权利要求2所述的口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，其特征在于所述的融合表达的整合型重组质粒是将枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因与人胰岛素原基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈克平，冯凡，胡平，连超群，吕鹏，唐琪，姚勤，袁弋，张春霞，陈亮，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：