本发明专利技术公开了一种具有穿膜功能的hMnSOD-R9及其制备方法与应用，属于分子生物学与生物化学领域。通过设计引物进行PCR扩增得到引入R9的MnSOD的hMnSOD-R9基因片段，将该片段连接到pET15b构建表达质粒pET15b-hMnSOD-R9，再将该质粒转化大肠杆菌表达宿主Rosetta-gami得到表达菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9。对该菌株进行诱导表达得到高效可溶的hMnSOD-R9，破碎表达菌体后直接对上清进行纯化，极大的简化生产工艺，降低了成本，解决了SOD工业化生产SOD原料的限制问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学与生物化学领域，涉及一种具有穿膜功能的hMnS0D-R9及其制备方法与应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是生物在进化过程中形成的广泛存在于生物体内的有效清除活性氧的主要金属酶类之一，它在抗氧化防御中发挥最重要的作用。SOD能够平衡机体的氧自由基，从而避免当机体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，受到国内外学者和研究者的广泛关注，研究领域已涉及到化学、生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科。SOD根据其辅基部位结合的不同金属离子分为4类锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)，铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)，铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和镍超氧化物歧化酶(N1-SOD)0 MnSOD主要存在于线粒体的基质中。线粒体是细胞的能量工厂，其氧化呼吸链的电子传递过程中是机体内自由基产生的最主要途径，所以Mn-SOD是清除02-的第一道防线。MnSOD基因的表达和调控对机体内自由基-自由基清除剂的平衡体系至关重要(HolleyAK, Dhar SK, Xu Y, St Clair DK. Manganese superoxide dismutase:beyond life anddeath. Amino Acids2012, 42:139-158.)。由于Mn-SOD的重要作用，作为药物酶制剂，具有医用价值及临床应用前景，其在疾病的基因治疗上有很多报道，如在乳腺癌，口腔癌等方面的应用(Chuang TC, Liu JY, et al. Human manganese superoxide dismutase suppressesHER2/neu-mediated breast cancer malignancy.FEBS Lett2007,581:4443-4449 ；Epperly MW, Wegner R, et al. Effects of MnSOD—plasmidliposome gene therapy onantioxidant levels in irradiated murine oral cavityorthotopic tumors. Radiat Res2007， 167:289-297.)。Mn-SOD的来源主要有以下几种一是直接从动物和植物体提取，来源丰富，但是提取和纯化工艺较复杂。二是利用生物工程基因重组生产，此法生产的SOD重组蛋白由于具有来源稳定、产量高、周期短、工艺简单、可规模化生产、易纯化等优点，得到越来越多的关注。迄今发现的MnSOD大约有30多种，已完成氨基酸序列全分析的MnSOD有近10种。其中通过分子克隆表达的MnSOD种类的有线虫、弓浆虫、橡胶树、萝卜、桃子、虾和人等。来源于其他物种的MnSOD对于人体来说具有更大的免疫原性。活性氧主要存在于细胞内，因此开发能透过细胞膜清除细胞内活性氧的SOD具有重要的意义。目前研究已表达的MnSOD都不含有蛋白转导域(Protein transduction domain, PTD),不能通过细胞膜，因此只能在细胞外起作用，大大限制了其活性的发挥。 以往采用显微注射法，电穿孔法，脂质体法，病毒载体等方法将生物大分子导入细胞内，对细胞毒性大且效率低。而蛋白转导域(PTD)是一类能携带其他生物大分子(蛋白质，多肽等)穿过多种哺乳动物细胞膜的短肽。常用的高效蛋白质转导结构域有黑腹果蚬触足肽(Antenapedia, Antp43_58), HIV-1 反式激活蛋白(Transactivatingprotein, TAT47-57)，单纯疱疹病毒转录调节蛋白(VP22)和精氨酸富含肽(Arginine-richpeptides)等。精氨酸富含肽蛋白转导域具有转膜速度快,转运效率高的特点,这位将外源性蛋白导入细胞提供了理想手段。研究发现,多聚精氨酸(Polyarginine)型蛋白转导域是含有九个精氨酸组成的跨膜肽(简称R9)，由于其带有高强度的正电荷，因此能够迅速与细胞膜结合，通过内吞等方式实现跨膜转运，有很高的跨膜转运效率，并且对细胞本身没有损伤，其穿膜作用不受细胞类型的限制(Fuchs SM, Raines RT. Polyarginine asa multifunctional fusion tag.Protein Sci 2005，14:1538-1544.)。有人曾用基因工程的方法，把pET_22b载体与从念珠藻中克隆的Fe-SOD基因连接构建成pET22b-FeS0D表达载体，并在大肠杆菌中成功表达，得到包涵体形式的融合蛋白(龚兴国.pET-SOD工程菌的构建及其表达纯化方法[P],中国专利:1962871A; 2007-5-16.)。虽然用基因工程的方法获得了融合蛋白，但是仍然存在一些问题有待解决。首先FeSOD相对于MnSOD对于活性氧的清除效果稍差。其次其FeSOD基因是从念珠藻中克隆的，表达念珠藻的FeSOD蛋白，对于人体的免疫排斥性较大，不利于以后的在人体上的应用。再次其表达的融合蛋白不含蛋白转导域，不能通过细胞膜，只能在细胞外起作用，大大限制了其清除活性氧作用的发挥。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克 服现有技术的缺点与不足，提供一种具有穿膜功能的hMnS0D-R9 (人源锰超氧化物歧化酶)。本专利技术的另一目的在于提供用于制备上述具有穿膜功能的hMnS0D-R9的质粒和菌株。本专利技术的再一目的在于提供在上述具有穿膜功能的hMnS0D-R9的制备方法。本专利技术的目的还在于提供上述具有穿膜功能的hMnS0D_R9的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种具有穿膜功能的hMnS0D-R9，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码上述具有穿膜功能的hMnS0D-R9的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。用于制备上述具有穿膜功能的hMnS0D-R9的质粒pET15b_hMnS0D-R9，由SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列与pET15b质粒构建而成。用于制备上述具有穿膜功能的hMnS0D_R9的菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnS0D-R9,通过将上述质粒pET15b_hMnS0D-R9转化大肠杆菌表达宿主Rosetta-gami 得到。上述具有穿膜功能的hMnS0D_R9的制备方法，包括如下步骤(l)Rosetta-gami/pET15b-hMnS0D-R9作为表达菌株，基于大肠杆菌表达系统进行诱导表达。(2)收集菌体，用裂解液重悬菌体，冰浴中超声破碎至溶液澄清，收集上清，用N1-NTA树脂纯化得到hMnS0D-R9。步骤(I)中所述的诱导表达的方法优选为挑取Rosetta-gami/pET15b-hMnS0D-R9单菌落接种于5mL含200mg/mL氨苄青霉素(AMP)的LB培养基于37 °C、220rpm培养过夜；按1:100的比例取2mL培养过夜菌液接种到200mL含200mg/mL AMP的LB培养基37°C、220rpm培养至菌液OD6tltl为O. 5左右时，加入终浓度为O. 5mM的IPTG，于30°本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有穿膜功能的hMnSOD?R9，其特征在于：所述的hMnSOD?R9的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种具有穿膜功能的hMnS0D-R9，其特征在于所述的hMnS0D_R9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。2.根据权利要求1所述的hMnS0D-R9，其特征在于编码所述的hMnS0D_R9的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3.用于制备权利要求1所述的hMnS0D-R9的质粒pET15b_hMnS0D-R9，其特征在于所述的质粒pET15b-hMnS0D-R9由SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列与pET15b质粒构建而成。4.用于制备权利要求1所述的hMnS0D_R9的菌株Rosetta-gami/pET15b_hMnS0D-R9,其特征在于所述的菌株Rosetta-gami/pET15b_hMnS0D-R9通过将权利要求3所述的质粒pET15b-hMnS0D-R9 转化 Rosetta-gami 得到。5.权利要求1所述的hMnS0D-R9的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)权利要求4所述的菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnS0D-R9作为表达菌株，基于大肠杆菌系统进行诱导表达； (2)收集菌体，用裂解液重悬重悬菌体，冰浴中超声破碎至溶液澄清，收集上清，用N1-NTA树脂纯化得到hMnS0D-R9。6.根据权利要求5所述的hMnS0D-R9的制备方法，其特征在于 步骤(I)中所述的诱导表达为挑取Rosetta-gami/pET15b_hMnS0D-R9单菌落接种于5mL含200mg...
【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，张自德，黄璐圆，吴秋红，张光，李秀英，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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