伐地那非的抗原模拟表位及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及伐地那非的抗原模拟表位，其氨基酸序列为CKFPSHPYC。本发明专利技术伐地那非抗原模拟表位可以替换价格昂贵的伐地那非标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于伐地那非的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然伐地那非分子相似的免疫反应特性，效果非常好，减少了伐地那非对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及伐地那非抗原模拟表位及其应用。
技术介绍
伐地那非(vardenafil, vard)是一种由德国拜耳公司生产的磷磷酸二酯酶_5抑制剂(PDE-5 inhibitors)，用于治疗男性阴茎勃起功能障碍。天然壮阳药品被认为安全、无副作用，深受世界各地消费者的亲睐，而在天然壮阳药中违法添加PDE-5抑制剂药物，会对公众健康产生一系列副作用，如头痛、面部潮红、消化不良、视力模糊和肌肉酸痛。PDE-5抑制剂与硝酸酯药物相互作用会导致严重的低血压。因此，加强天然壮阳药物中非法添加PDE-5抑制剂的检测对人类的健康意义重大。目前，筛查违法添加的伐地那非的检测方法包括LC-MS、GC-MS和LC/ES1-MS/MS，虽然上述方法灵敏、精确、可靠，但所需设备昂贵且运行费用高，很难在基层工作中大规模开展。免疫学检测方法具有灵敏、特异、快速和廉价的特点，已广泛运用于食品和环境样品的快速检测。但是该方法必须使用vard标准品，不仅增加了检测成本，而且对检测人员及环境易造成危害，在一定程度上制约了免疫学方法的应用和推广。有鉴于此，人们开始采用抗独特型抗体及抗原模拟表位技术来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。噬菌体展示技术为获得vard的代替品提供了技术支持。本专利技术通过用噬菌体展示肽库技 术，从肽库中筛选出能与靶分子(抗伐地那非单克隆抗体)特异性结合的多肽(抗原模拟表位)，该抗原模拟表位具有与天然伐地那非分子相似的免疫反应特性，通过获得的伐地那非抗原模拟表位，以代替价格昂贵且毒性强的伐地那非标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于伐地那非的免疫学检测。
技术实现思路
本专利技术以抗伐地那非单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入噬菌体随机展示环七肽库，进行亲和淘选，获得了 I种伐地那非的抗原模拟表位，其氨基酸序列如下伐地那非抗原模拟表位从噬菌体随机环七肽库中筛选的伐地那非抗原模拟表位(多肽)，其氨基酸序列为CKFPSHPYC。上述抗原模拟表位(多肽)结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即C代表半胱氨酸残基，K代表赖氨酸残基,F代表苯丙氨酸残基，P代表脯氨酸残基，S代表丝氨酸残基，H代表组氨酸残基，Y代表酪氨酸残基。抗原模拟表位的N末端和C末端的两个半胱氨酸残基形成分子内二硫键,为环状结构。本专利技术还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，优选为AAG TTTCCG TCG CAT CCT TAT。本专利技术提及的伐地那非抗原模拟表位(多肽)可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有伐地那非抗原模拟表位(多肽)的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有伐地那非抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行伐地那非抗原模拟表位的大量制备。本专利技术还涉及所述伐地那非抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。本专利技术伐地那非抗原模拟表位(CKFPSHPYC)在应用时，可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析，将通过噬菌体扩增获得的展示有伐地那非抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将伐地那非抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替伐地那非标准品来进行免疫学检测分析。还涉及伐地那非抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。 还涉及伐地那非抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。前述伐地那非抗原模拟表位可以替换价格昂贵的伐地那非标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于伐地那非的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然伐地那非分子相似的免疫反应特性，效果非常好。本专利技术的有益效果是本专利技术伐地那非抗原模拟表位可以替换价格昂贵的伐地那非标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于伐地那非的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然伐地那非分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了伐地那非对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。附图说明图1以伐地那非抗原模拟表位建立的间接竞争ELISA标准曲线。线性检测范围为(2. 4 - 32) ng/mL, IC50 为 8. 8 ng/mL。具体实施例方式实施例1.伐地那非抗原模拟表位的亲和淘选及其鉴定I)伐地那非抗原模拟表位的亲和淘选具体方法为用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗伐地那非单克隆抗体，并以终浓度100 μ g/mL包被96孔酶标板，4°C孵育过夜。第二天用TBST (50 mM NaCl, pH 7. 5 包含 O. 1% Tween-20 (v/v))洗涤 10 次后，加入 300 μ I 封闭液(3% BSA-PBS)4°C孵育2小时。2小时后弃封闭液，用TBST洗涤5次，每孔加入100μ I噬菌体肽库(噬菌体展示环七肽库或十二肽库，购自NEB公司，用TBS 10倍稀释噬菌体原液，约1. OXlO11 pfu)，22-26°C振荡反应I小时。弃去未结合的噬菌体，用TBST洗涤10次，结合上的噬菌体用O. 2 M Glycine-HCl (pH 2.2)洗脱，并立即用15 μ I I M Tris-HCl(pH 9.1)中和。取10 μ I洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20 mL生长至对数前期的Ε. coli ER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。在第二、第三轮的淘选过程中，包被的抗伐地那非单克隆抗体浓度分别为75 μ g/mL和50 μ g/mL,所用的TBST浓度为O. 25%和O. 5%，其余步骤同上。2)阳性噬菌体克隆的鉴定从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取20个曬菌体斑,进行曬菌体的扩增,采用间接酶联免疫吸附检测方法(Indirect EnzymeLinked immunoasorbent assay,1-ELISA)进行阳性卩遼菌体克隆的鉴定,具体方法为首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗伐地那非单克隆抗体，10 Pg/mL包被96孔酶标板，4°C孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育I小时；投入100 μ 噬菌体斑扩增液(1. OX IO11 pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37 °C孵育I小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 μ1，37 °C孵育I小时；加入ΙΟΟμΙ TMB底物液，避光显色5min，酶标仪(ThermoScientific Mult本文档来自技高网...

【技术保护点】
伐地那非的抗原模拟表位，其特征在于氨基酸序列为CKFPSHPYC。

【技术特征摘要】
1.伐地那非的抗原模拟表位，其特征在于氨基酸序列为CKFPSHPYC。2.编码权利要求1所述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的核苷酸序列AAGTTT CCG TCG CAT CCT TAT。4.如权利要求1所述抗原模拟表位的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体粒子；所述化学...

【专利技术属性】
技术研发人员：何庆华，许杨，刘星，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：