一种黄芩毛状根保藏和复壮方法技术

本发明专利技术公开了一种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，属于植物细胞保藏技术领域，本发明专利技术的技术方案主要包括以下步骤：将经挑选的黄芩毛状根根尖部在液体培养基中避光培养至对数生长期；挑选经液体培养得到的黄芩毛状根，加入保藏培养基中，室温下，避光静置保藏；取保藏培养的黄芩毛状根，接种到活化培养基中，避光培养20～25d；取活化后的黄芩毛状根，接入复壮培养基，25～28℃避光培养15～20d。本发明专利技术提供的保藏和复壮方法成本低廉，操作简便，解决了液氮保藏专业性要求高、费用大和常规冷藏保藏操作过于繁琐的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物细胞保藏
，涉及ー种黄芩毛状根的保藏和复壮方法。
技术介绍
植物细胞保藏技术是生产和研究的基础，其原理是通过人工方法使细胞进入休眠状态，降低其生长代谢活动，达到抑制细胞增殖和减少变异的目的。常用的植物细胞保藏方法有液氮超低温保藏法和低温冷蔵法液氮保藏需专用器具、成本高，一般只在专业保藏机构中使用；实验室多采用低温冷蔵法保藏植物细胞，但保存过程会因代谢产物累积而改变其生存环境，一般I 4个月须重新进行转接保藏，虽不需特殊设备，但烦琐费吋，故仅限于短期保藏，且经常移植容易弓I起细胞退化。黄岑(Scutellariabaicalensis Georgi),为唇形科(Labiatae)植物，其药用部位为黄芩干燥根，性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。黄芩主要分布于河北、辽宁、陕西、山东、内蒙古等地，主要成分是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、黄芩酮1、黄芩酮I1、千层纸黄素A及菜油留醇等。近年来，研究发现其主要有效成分黄芩苷有抗HIV、抗肿瘤、抗氧化及清除氧自由基等作用，随着新药不断开发，黄芩用量在迅速増加，黄芩资源的可持续发展问题日显重要。毛状根培养技术是20世纪80年代后期在植物细胞领域发展起来的一项新技木，与一般的植物细胞培养相比，毛状根可以生长在不含激素的培养基上。在诱导出毛状根的基础上，结合细胞培养技术建立起毛状根培养系统。这ー培养系统对传统药材来说很重要，因为约1/3的传统中药材是植物的根部，曾经被认为难以通过细胞培养来生产的许多源于植物根部的药物，现在正被设法通过培养毛状根来生产。毛状根培养遵循一般的生长模式，代谢产物不一定是生长相关的，但是毛状根的遗传性能和次级代谢产物合成能力比较稳定，为进行毛状根的高密度培养创造了较好的有利条件。因此，毛状根培养技术已被认为是生产药用植物次生代谢产物的一条重要途径，具有非常广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，通过对保藏和复壮条件的优化，实现了黄芩优良毛状根株系的保存。本专利技术是通过以下技术方案来实现—种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，包括以下步骤I)挑选处于对数生长期的黄芩毛状根，接种入保藏培养基中，室温下，避光静置保藏；所述的保藏培养基pH为5. 5 6. 5,包括I 4g じ1鹿糖、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、0.5 1. Omg じ1盐酸硫胺素、0.1 0. 5mg じ1盐酸批P多醇、0.1 1. Omg じ1烟酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分；2)取保藏培养的黄芩毛状根，接种到活化培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养20 25天；所述的活化培养基 pH为5. 5 6. 5，包括10 30g じ1蔗糖、100 500mg じ1水解乳蛋白、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、0. 5 1. Omg じ1盐酸硫胺素、0.1 0.5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0.1 1. Omg じ1烟酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分；3)取活化后的黄芩毛状根，接种入复壮培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养20 25天；所述的复壮培养基pH为5. 5 6. 5，包括0.1 0. 4mmol じ1苯丙氨酸、30 60g じ1葡萄糖、500 IOOOmg じ1水解乳蛋白、1. 0 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5 2.5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5 1. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1烟酸和50 200mg じ1肌醇，以及无机盐部分；所述的无机盐部分包括50 150mg L-1KH2PO4^OO 2000mg じ1KNO3UOO 300mg じ1MgSO4 7H20、200 500mg じ1CaCl2 2H20、10 30mg じ1Na2EDTA 2H20、I 5mg [1H3BO3J 20mg じ1FeSO4 7H20、0. 01 0. 05mg じ1CuSO4 5H20、2 IOmg じ1 ZnSO4 7H20、0.1 0. 5mg じ1Na2MoO4 2H20、0. 01 0. 05mg じ1CoCl2 6H20、0.2 0. 5mg じ1KI 和 5 20mg じ1MnSO4 4H20。所述的对数生长期的黄芩毛状根的获得为将挑选的黄芩毛状根的根尖部，接种入液体培养基，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养至对数生长期；所述的液体培养基pH为5. 5 6. 5，包括30 50g じ1蔗糖，300 IOOOmg じ1水解乳蛋白，0. 5 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5 2. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5 1.5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1烟酸和50 200mg じ1肌醇，以及无机盐部分。所述挑选是选取毛状根生物量和黄芩苷含量高的株系，在无菌条件下挑取色浅、根系直、分枝多且根表面微绒毛明显的黄芩毛状根根尖部，挑取部位包含I 5个生长点，分枝长度0. 2 1. 0cm。所述将黄芩毛状根的根尖部以0. 5 0. 8%的接种量接入液体培养基，IlOr min'25 28°C避光培养15 20天至对数生长期。所述取活力旺盛、同步生长、处于对数生长期的黄芩毛状根，按0. 5 0. 8%的接种量接种入保藏培养基中，于24 26°C避光，静置保藏5 18个月。所述取保藏培养的黄芩毛状根，按0. 2 0. 6%的接种量接种到活化培养基中后，在 25 28°C、110r mirT1 下培养 20 25 天。所述在活化后的黄芩毛状根新鮮根部位挑取色浅、根系直，包含I 5个生长点，分枝长度0. 2^0. 5cm的根尖部黄芩毛状根，按0. 2 0. 6%的接种量接种到复壮培养基中后，在25 28°C、110r mirT1下培养20 25天。所述取复壮后的黄芩毛状根作为种子，接种入用于生产黄芩苷的培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养35 50天生产黄芩苷。所述用于生产黄岑苷的培养基pH为5. 5 6. 5,包括0.1 0. 4mmol じ1苯丙氨酸、30 60g じ1鹿糖、500 IOOOmg じ1水解乳蛋白、1. 0 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5 2.5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5 1. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1烟酸和50 200mg じ1肌醇，以及无机盐部分。—种黄岑毛状根的室温保藏培养基,该培养基pH为5. 5 6. 5,包括I 4g L 1鹿糖、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、0. 5 1. Omg じ1盐酸硫胺素、0.1 0. 5mg じ1盐酸卩比ロ多醇、0.1 1. Omg じ1烟酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。所述的无机盐部分包括50 150mg L-1KH2PO4^OO 2000mg じ1KNO3、100 300mg じ1MgSO4 7H20、200 500mg じ1CaCl2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，包括以下步骤：1）挑选处于对数生长期的黄芩毛状根，接种入保藏培养基中，室温下，避光静置保藏；所述的保藏培养基pH为5.5～6.5，包括1～4g·L?1蔗糖、0.5～2.0mg·L?1甘氨酸、0.5～1.0mg·L?1盐酸硫胺素、0.1～0.5mg·L?1盐酸吡哆醇、0.1～1.0mg·L?1烟酸和10～100mg·L?1肌醇，以及无机盐部分；2）取保藏培养的黄芩毛状根，接种到活化培养基中，在25～28℃、避光震荡或摇瓶培养20～25天；所述的活化培养基pH为5.5～6.5，包括10～30g·L?1蔗糖、100～500mg·L?1水解乳蛋白、0.5～2.0mg·L?1甘氨酸、0.5～1.0mg·L?1盐酸硫胺素、0.1～0.5mg·L?1盐酸吡哆醇、0.1～1.0mg·L?1烟酸和10～100mg·L?1肌醇，以及无机盐部分；3）取活化后的黄芩毛状根，接种入复壮培养基中，在25～28℃、避光震荡或摇瓶培养20～25天；所述的复壮培养基pH为5.5～6.5，包括0.1～0.4mmol·L?1苯丙氨酸、30～60g·L?1葡萄糖、500～1000mg·L?1水解乳蛋白、1.0～4.0mg·L?1甘氨酸、0.5～2.5mg·L?1盐酸硫胺素、0.5～1.5mg·L?1盐酸吡哆醇、0.5～2.0mg·L?1烟酸和50～200mg·L?1肌醇，以及无机盐部分；所述的无机盐部分包括：50～150mg·L?1KH2PO4、500～2000mg·L?1KNO3、100～300mg·L?1MgSO4·7H2O、200～500mg·L?1CaCl2·2H2O、10～30mg·L?1Na2EDTA·2H2O、1～5mg·L?1H3BO3、5～20mg·L?1FeSO4·7H2O、0.01～0.05mg·L?1CuSO4·5H2O、2～10mg·L?1ZnSO4·7H2O、0.1～0.5mg·L?1Na2MoO4·2H2O、0.01～0.05mg·L?1CoCl2·6H2O、0.2～0.5mg·L?1KI和5～20mg·L?1MnSO4·4H2O。...

【技术特征摘要】
1.一种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，包括以下步骤 1)挑选处于对数生长期的黄芩毛状根，接种入保藏培养基中，室温下，避光静置保藏；所述的保藏培养基pH为5. 5 6. 5,包括I 4g · L-1鹿糖、O. 5 2. Omg · L-1甘氨酸、O.5 1. Omg *L_1盐酸硫胺素、O.1 O. 5mg *L_1盐酸批卩多醇、O.1 1. Omg *L_1烟酸和10 IOOmg · L-1肌醇，以及无机盐部分； 2)取保藏培养的黄芩毛状根，接种到活化培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养20 25天；所述的活化培养基pH为5. 5 6. 5，包括10 30g Γ1蔗糖、100 500mg Γ1水解乳蛋白、O. 5 2. Omg · L—1甘氨酸、O. 5 1. Omg · L—1盐酸硫胺素、O.1 O. 5mg · L—1盐酸批卩多醇、O.1 1. Omg · L-1烟酸和10 IOOmg · L-1肌醇，以及无机盐部分； 3)取活化后的黄芩毛状根，接种入复壮培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养20 25天；所述的复壮培养基pH为5. 5 6. 5，包括O.1 O. 4mmol Γ1苯丙氨酸、30 60g *L_1 葡萄糖、500 IOOOmg *L_1 水解乳蛋白、1. O 4. Omg *L_1 甘氨酸、O. 5 2. 5mg *L_1盐酸硫胺素、O. 5 1. 5mg · L—1盐酸批B多醇、O. 5 2. Omg · L—1烟酸和50 200mg · L—1肌醇，以及无机盐部分； 所述的无机盐部分包括50 150mg · L-1KH2PO4^OO 2000mg · T1KNO3UOO 300mg · IZ1MgSO4 · 7H20、200 500mg · IZ1CaCl2 · 2H20、10 30mg · IZ1Na2EDTA · 2H20、I 5mg · IZ1H3BO3J 20mg · IZ1FeSO4 · 7Η20、0· 01 O. 05mg · !/1CuSO4 · 5H20、2 IOmg · T1ZnSO4 · 7Η20、0· I O. 5mg · L^1Na2MoO4 · 2Η20、0· 01 0. 05mg · T1CoCl2 · 6H20、0.2 0. 5mg · L-1KI 和 5 20mg · L-1MnSO4 · 4H20。2.如权利要求1所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，所述的对数生长期的黄芩毛状根的获得为 将挑选的黄芩毛状根的根尖部，接种入液体培养基，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养至对数生长期；所述的液体培养基pH为5. 5 6. 5，包括30 50g · Γ1蔗糖，300 IOOOmg · L—1水解乳蛋白，O. 5 4. Omg · L—1甘氨酸、O. 5 2. 5mg · L—1盐酸硫胺素、O. 5 1.5mg · L-1盐酸批B多醇、O. 5 2. Omg · L-1烟酸和50 200mg · L-1肌醇，以及无机盐部分。3.如权利要求2所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，所述挑选是选取毛状根生物量和黄芩苷含量高的株系，在无菌条...

【专利技术属性】
技术研发人员：施春阳，齐香君，钱卫东，李雅，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：