本发明专利技术公开了一种兔肝内的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，属于生物医药技术领域。包括如下步骤：（1）上皮细胞分离，纯化，培养；（2）细胞生长线测定；（3）鉴定。本发明专利技术胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法通过多步分离方法获得纯度较高的胆管上皮细胞，并建立了胆管上皮细胞的长时间增殖培养体系，并首次发现Rho激酶抑制剂Y-27632可显著性地促进肝内胆管上皮细胞的增殖，具有操作较为简单，适合推广与应用等优点，并可为研究胆道闭锁和原发性胆汁肝硬化等在内的多种疾病机理提供平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种兔肝内，属于生物医药
技术介绍
胆管上皮细胞异常病理可引发包括胆道闭锁和原发性胆汁肝硬化等在内的多种疾病，研究这些疾病发病机制的其中ー个理想方法是建立体外的胆管上皮细胞可扩增培养体系。采用不同的分离纯化方法，研究人员已先后从人和啮齿类动物胆管组织中分离培养出胆管上皮细胞，迄今尚未见到兔胆管上皮细胞分离培养的研究报道。兔子是常用的实验动物，取材经济方便，兔子肝脏的多方面生理及生化指标与人类有许多相似的特点，因此是人类肝脏疾病动物模型重要的补充。目前，国内外报道成功的正常肝内胆管上皮细胞的培养方法主要组织块培养法，密度梯度离心法和细胞分选法等，但这些方法存在细胞纯度不高，体外培养的原代胆管上皮细胞増殖能力弱，无法进行长时间的可扩增培养，以及研究材料往往需要涉及整肝组织，肝组织消耗较大等缺陷，如细胞分选法是获得高纯度胆管上皮细胞的有效方法，但细胞分选需要有专门的分选设备如流式细胞仪，分选获得的单个细胞也并十分适合胆管上皮细胞的生长，且目前缺乏胆管上皮细胞的特异性表面标志物，这些因素制约着细胞分选技术的开展应用；密度梯度离心法可以在一定程度上纯化胆管上皮细胞，但也不可避免地混合其他种类的细胞如肝星型细胞和成纤维样细胞，因而细胞纯度不高；组织块培养法优点是最大程度地保留了体内胆管上皮细胞的生物学特性，因而也具有较好的生长活性，但这一方法同样可以促进成纤维样细胞、肝细胞与胆管上皮细胞的混合生长，纯度较低；国内外可供应用的正常肝内胆管上皮细胞株很少，性状不稳定，容易发生恶性转化；尽管已有一些胆管上皮细胞分离培养的研究报道，但研究结果显示已有的大部分培养体系无法长时间地維持细胞的増殖，即使在添加EGF和HGF等细胞因子的情况下，也只能适当延长细胞的存活时间，效果并不十分显著。 有基于此，做出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。实现本专利技术目的所采取的技术方案如下 肝，包括如下步骤 (1)上皮细胞分离，纯化，培养； (2)细胞生长线測定； (3)鉴定。其中(I)上皮细胞分离，纯化，培养取5 — 20克的肝脏组织，剪成约Imm3的小块，在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中浸泡洗漆3次后,在37°C的摇床中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)高糖培养基消化组织块30-60分钟，收集细胞1200r/min离心5min，重复3遍去除胶原酶；纯化肝胆管上皮细胞，将纯化后的肝胆管上皮细胞分别以克隆状密度(50细胞/cm2)接种于事先配置好的培养基(DMEM+10%FBS (fetal bovine serum,胎牛血清)+ITS (Insulin-Transferrin-Selenium)中，于37°C、5% (体积体积比)的CO2中培养6-10天后，无菌条件下用玻璃分针切割胆管上皮细胞集落为小细胞团(20个-50个细胞团块)，并转移至新的培养皿或培养板中进ー步传代培养。(2)细胞生长线的测定将细胞以每孔5X103个细胞接种于有matrigel包被的4孔板中，每孔体积为500 u 1，置于37°C的5% (体积比)CO2中培养，分别于培养的第5_7天消化收集并測定细胞浓度。(3)培养细胞的鉴定包括免疫细胞化学染色和胆管样结构形成，a.免疫细胞化学染色用4% (体积比)多聚甲醛在室温下固定步骤(I)培养的胆管上皮细胞20 min (加入多聚甲醒前吸掉培养基，并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)清洗2-3遍),加入0. 4% (体积比)Triton X-100透膜15 min,用PBS冲洗3遍后；加入5% (体积比)的羊血清，室温下封闭0.5 h，加入ー抗，37°C孵育40 min或4°C过夜，去掉ー抗后，PBS冲洗3次后，进行DAB (辣根过氧化酶检测试剂盒)显色，倒置显微镜下检测，毎次实验检测的细胞数大约为I 000个； b.胆管样结构形成将Matrigle用DMEM以1:1稀释，包被在培养皿或培养板上形成5mm厚的三维Matrigle培养体系，Ih后将5代内的胆管上皮细胞以I X 105/cm2细胞密度接种在三维Matrigel上培养5 — 7天，其中，培养液为DMED/F12中加入10%FBS(Hyclone公司)，20ng/ml HGF (hepatocytes growth factor, HGF,肝细胞生长因子)，I X ITS 和2mM谷氨酸。 本专利技术技术方案的进ー步设置如下 步骤(I)中，所述的纯化是指向分离的细胞中加入适当体积(细胞裂解液与细胞体积比为5:1)的红细胞裂解液，充分混匀，红细胞充分裂解后，配平，以1200r/min的速度离心5分钟重复三遍，裂解红细胞；收集细胞，将细胞悬浮于DMEM高糖培养基(Dulbecco’ sModified Eagle Medium)中，50g/min,离心lmin,重复三遍,收集上清液中的非实质性肝细胞。步骤(I)中，所述的胆管上皮细胞培养基成分为a -MEM (alpha MinimumEssential Medium) /DMEM (质量比为 1:1)+ FBS + ITS + IOnmoI/L Y-27632 + 100 u g/ml青链霉素。步骤(I)中，培养用到的培养皿或者培养板均预先用250 ii g/ml matrigel于37°C 包被 Ih。在本专利技术技术方案的分离纯化方法中，首先采用红细胞裂解液裂解数量丛多的红细胞，然后用密度梯度离心法去除成熟肝细胞获得非实质性肝脏细胞，由于成熟肝细胞密度和体积均比较大，在50g/min，离心Imin情况下可以沉淀至离心管底部，而肝内其他细胞仍保留在上清液中。在培养的非实质性肝细胞中，本技术方案获得了胆管上皮细胞和其它类型的细胞，由于是克隆状密度生长，胆管上皮细胞得以生成大的细胞集落，在此基础上我们通过显微镜下用玻璃针剥离胆管上皮细胞集落，即可获得了高纯度的胆管上皮细胞。其中，matrigel富含层粘链蛋白、胶原等细胞外基质,这一成分与胆管上皮细胞的体内微环境极为相似；Y-27632是Rho信号通路的抑制剂，可促进多种上皮型干细胞的增殖与存活，同样对胆管上皮细胞的増殖具有积极的作用，细胞外基质Matrigel进行包被预处理，促进胆管上皮细胞的生长和増殖，实现胆管上皮细胞的长时间扩增培养，并可促使细胞体外连续传代。本技术方案首次采用ニ维的matrigel作为细胞外基质，在Y-27632存在的情况下，可显著性地提高胆管上皮细胞的体外扩增效率，这ー结果表明Y-27632对上皮细胞的増殖作用可能具有普遍意义。综上所述，本研究通过多步分离方法获得纯度较高的胆管上皮细胞，并建立了胆管上皮细胞的长时间增殖培养体系，并首次发现Rho激酶抑制剂Y-27632可显著性地促进肝内胆管上皮细胞的増殖。这ー培养体系操作较为简单，适合推广与应用，并可为研究胆道闭锁和原发性胆汁肝硬化等在内的多种疾病机理提供平台。附图说明图1为原代和传代培养的胆管上皮细胞及Y-27632对细胞的增殖作用((A)原代培养的非实质性肝细胞，白色虚线所围为胆管本文档来自技高网...
【技术保护点】
胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）上皮细胞分离，纯化，培养；（2）细胞生长线测定；（3）鉴定。
【技术特征摘要】
1.胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)上皮细胞分离，纯化，培养； (2)细胞生长线测定； (3)鉴定。2.根据权利要求1所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)上皮细胞分离，纯化，培养取5— 20克的肝脏组织，剪成面积为Imm3的组织块，在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中浸泡洗漆3次后,在37°C温度下,用含5mg/ml IV型胶原酶的DMEM高糖培养基消化组织块30-60分钟，收集细胞并于1200r/min下离心5min，重复3遍后，去除胶原酶，得分离的肝胆管上皮细胞，并进行纯化；将纯化后的肝胆管上皮细胞分别以50个细胞/cm2接种于事先配置好的培养基中，于37°C、5%的CO2中培养6-10天后，无菌条件下将胆管上皮细胞集落切割，每20 -50个细胞团块作为一个，并转移至新的培养皿或者培养板中进一步传代培养； (2)细胞生长线测定将细胞以每孔5XIO3个细胞接种于有matrigel包被的4孔板中，置于37°C、5%的CO2培养，分别于培养的第5-7天测定细胞浓度，其中，四孔板每孔加入培养液的体积500 ill ; (3)培养细胞的鉴定包括免疫细胞化学染色和胆管样结构形成， a.免疫细胞化学染色用4%多聚甲醛在室温下固定培养的胆管上皮细胞，20min分钟后，吸掉4%多聚甲醛，加入0. 4%Triton X-100透膜15 min,用PBS冲洗3遍后；加入5%的羊...
【专利技术属性】
技术研发人员：金立方，倪坚，
申请(专利权)人：绍兴文理学院，
类型：发明
国别省市：
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