本申请公开了分离和纯化的金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素，其在本文中被称为LukAB，及其组分LukA和LukB，LukA特异性抗体、LukB特异性抗体、含有LukA和/或LukB的治疗组合物、或抗-LukA和/或抗-LukB的抗体、使用这些组合物治疗急性炎症或金黄色葡萄球菌感染的用途、鉴定LukAB-介导人吞噬细胞细胞毒性抑制剂的方法、以及使用LukAB作为标记物预测金黄色葡萄球菌感染严重性的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途相关申请的交叉引用本申请要求在2010年5月5日提交的美国临时专利申请号No.61/331,550的优先权，其通过引用并入本文。序列表本申请包括了一份通过EFS-Web提交的序列表，其公开内容在此参考并入。所述ASCII拷贝创建于2011年5月2日，并被命名为SequenceListing_StaphylococcusAureusLeukocidinsST25.txt，大小为102Kb。专利技术背景金黄葡萄球菌或“葡萄球菌”通常可在人和动物的皮肤或鼻孔内发现。葡萄球菌一般情况下是无害的，除非其通过切口或其他伤口进入身体。在健康人身上，典型的葡萄球菌感染是很小的皮肤问题。以前，葡萄球菌感染使用广谱抗菌素，如甲氧西林进行治疗。然而，现在出现了一些耐药葡萄球菌菌株，其对甲氧西林和其他β-内酰胺类抗生素，如青霉素和头孢菌素有耐药性。它们被称为甲氧西林耐药性金黄葡萄球菌(也称多药耐药性金黄葡萄球菌，或″MRSA″)。葡萄球菌感染，包括MRSA，开始通常为类似丘疹、疖子或蜘蛛咬伤一样的小红肿包。这些肿包或缺损可能很快转化为需要外科手术排脓治疗的深度、疼痛型脓肿。有时，细菌仅限于皮肤。在有些情况下，它们可能深入到身体内部，并可能导致危及生命的人体多个组织的感染，包括皮肤、软组织、骨头、关节、外科手术伤口、血液系统、心脏瓣膜、肺部、或其他器官。因此金黄葡萄球菌感染可能变成致命性疾病，例如，坏死性筋膜炎、肺炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克综合征以及各种形式的肺炎。在医院或医疗环境下MRSA感染是特别麻烦的，患者常常会有开放性创伤、侵入性器械和免疫系统衰弱，所以比在公共场合中有更高的感染风险。没有遵循正确卫生程序的操作人员可能将MRSA细菌从一名患者传递给另外一名患者。金黄葡萄球菌产生一系列的不同的毒力因子和毒素，它们能使该细菌中和并抵抗各种类型免疫细胞的攻击，特别是白细胞的亚群，白细胞组成身体主要抵御系统。这些毒力因子和毒素的产生可以让金黄色葡萄球菌保持感染状态。参见Nizet，J.AllergyClin.Immunol.120：1322(2007)。在这些毒力因子中，金黄色葡萄球菌可产生各种双组分的白细胞毒素，这些毒素通过两种非结合的蛋白或亚单位的协同作用破坏宿主防御细胞和红细胞的细胞膜。参见，Supersac，等，Infect.Immun.61：580-7(1993)。在这些双组分的白细胞毒素中，γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)和潘通-瓦伦丁(Pantone-Valentine)杀白细胞素(PVL)是最具代表的。杀白细胞素对哺乳动物细胞的毒性涉及两个组分的作用。第一个亚单位命名为S亚单位级(即，慢洗脱的亚单位)，第二个亚单位命名为F亚单位级(即，快洗脱的亚单位)。S亚单位和F亚单位协同作用可在白细胞上形成孔洞，白细胞包括单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞(统称为吞噬细胞)。参见，Menestrina，等，Toxicol.39：1661-1672(2001)。双组分的毒素在靶细胞膜上形成孔洞的机制还没有完全了解。这些毒素可能的作用机制包括S亚单位与靶细胞膜的结合，该结合很可能是通过一个受体，然后F亚单位结合到S亚单位上，从而形成一个低聚物，该低聚物形成了插入靶细胞膜的前孔洞(Jayasinghe，等，Protein.Sci.14：2550-2561(2005))。双组分白细胞毒素形成的孔洞是典型的阳离子选择性的。孔洞的形成会导致细胞的裂解死亡，已有报道在白血球细胞中，其裂解死亡是由于阳离子汇集导致的渗透压不平衡所致(Miles，等，Biochemistry40：8514-8522(2001))。除了PVL(即S/F-PV或LukSF-PV)以及γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)，金黄色葡萄球菌产生的双组分组成中还包括杀白细胞素E/D(LukED)和杀白细胞素M/F’(LukMF’)。因此，这些双组分杀白细胞素的S亚单位包括HlgA、HlgC、LukE、LukS-PV、和LukM，F亚单位包括HlgB、LukD、LukF-PV、和LukF’-PV(Menestrina，等，如上所述)。金黄色葡萄球菌的S-和F-亚单位不是杀白细胞素所特有的。即，其可以相互替换，这就使其他的双组分组合可以在白血球细胞上形成功能性孔洞，从而大大增加了杀白细胞素的组成(Meyer，等，Infect.Immun.77：13-22(2009))。开发对MRSA感染的有效治疗已经变得很有必要。除了对前述的甲氧西林和相关的抗生素的耐药性，MRSA还发现对大环内脂类(如，红霉素)、β-内酰胺酶抑制剂复合物(如，舒巴坦、奥格门汀)以及氟喹诺酮类(如，环丙沙星)，还有克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑(复方新诺明)和利福平具有显著的抗药性。在严重的金黄色葡萄球菌感染中，临床医生已经开始使用静脉给予万古霉素。然而，金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药已有报道。所以，有必要开发可以有效抵抗金黄色葡萄球菌感染的新型抗菌药物。专利技术概述申请人发现并鉴定了金黄色葡萄球菌天然存在的防御系统中的另外一个双组分成员。新鉴定的天然S亚单位多肽组分在本申请中被称为“LukA”，其包含天然多肽及其类似物，天然多肽的类似物与天然多肽的序列有至少70％的相似性。因此，本专利技术的一方面涉及LukA的分离和/或纯化。本专利技术的另一方面涉及编码LukA的分离和/或纯化的多核苷酸，含有该多核苷酸的转染宿主(如，细胞)，以及通过在转染宿主中表达多核苷酸制备重组LukA的方法。新鉴定的F亚单位多肽组分在本申请中被称为“LukB”，其包含天然多肽及其类似物，天然多肽的类似物与天然多肽的序列有至少70％的相似性。因此，本专利技术的一方面涉及LukB的分离和/或纯化。本专利技术的另一方面涉及编码LukB的分离和/或纯化的多核苷酸，含有该多核苷酸的转染宿主(如，细胞)，以及通过在转染宿主中表达多核苷酸制备重组LukB的方法。然而，本申请的另外一方面涉及治疗组合物，该组合物含有制备于药学上可接受的药物载体中的治疗有效量的LukA和/或LukB，可用于抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗。因此，在一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的LukA。在另一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的LukB。在另一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的LukA和LukB。在其他实施方式中，组合物包含LukA的类似物，其缺少10C-端残基且没有毒性(本申请中称为LukAΔ10C或rLukAΔ10C)。这些组合物具有多种治疗用途。在一些实施方式中，组合物称为抗炎组合物，并可被用于治疗急性炎症或疾病，特别是局部急性炎症情况。这些用途运用了申请人的其他发现，即在生理条件下(即，LukAB直接由金黄色葡萄球菌产生)，LukAB复合物对吞噬细胞具有特别的特异性，而对其他有核细胞则无，所述有核细胞例如上皮细胞和内皮细胞。也就是说，复合物在这些种类的细胞膜上形成孔洞，从而导致细胞死亡，这在本申请中称为“LukAB介导的细胞毒性”。另外一方面，LukAB对其他有核哺乳动物细胞具有相对较小或可忽略不计的特异性。因此，本专利技术的抗炎组合物利用了LukAB对人类吞噬细胞的特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.05 US 61/331,5501.活性剂，包括：(a)用于抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的治疗有效量的LukA多肽，其中所述LukA多肽是由SEQIDNO:2-14中任意一个的氨基酸残基28-351的氨基酸序列组成的成熟的LukA多肽，或由SEQIDNO:2-14中任意一个的氨基酸残基28-351，但缺少对应于氨基酸残基342-351的氨基酸序列组成的LukA多肽，和(b)用于抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的治疗有效量的LukB多肽，其中所述LukB多肽是由SEQIDNO:16-27中任意一个的30-339位氨基酸残基组成的成熟的LukB多肽。2.治疗组合物，所述治疗组合物包括如权利要求1所述的活性剂，和药学上可接受的载体。3.如权利要求2所述的治疗组合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制在哺乳动物对象中金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗。4.根据权利要求1所述的活性剂，其中所述LukA多肽是成熟的LukA多肽，其由对应于SEQIDNO:2、6或12的氨基酸残基28-351的氨基酸序列组成，并且所述LukB多肽是成熟的LukB多肽，其由对应于SEQIDNO:21、23或27的氨基酸残基30-339的氨基酸序列组成。5.根据权利要求1所述的活性剂，其中所述LukA多肽是成熟的LukA多肽，其由对应于SEQIDNO:2、6或12的氨基酸残基28-351，但缺少对应于氨基酸残基342-351的氨基酸序列组成，和所述LukB多肽是成熟的LukB多肽，其由对应于SEQIDNO:21、23或27的氨基酸残基30-339的氨基酸序列组成。6.根据权利要求1所述的活性剂，其中所述LukA多肽是成熟的LukA多肽，其由对应于SEQIDNO:2的氨基酸残基28-351的氨基酸序列组成，并且所述LukB多肽是成熟的LukB多肽，其由对应于SEQIDNO:27的氨基酸残基30-339的氨基酸序列组成。7.根据权利要求3所述的用途，其中所述金黄色葡萄球菌感染是MRSA感染。8.鉴定LukAB-介导的细胞毒性的抑制剂的方法，所述方法包括a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物相接触，随后在允许LukA和LukB对吞噬细胞进行攻毒的条件下加入LukA和LukB；b)将a)中的吞噬细胞与可透过细胞或不可透过细胞的检测标记相接触；以及c)检测吞噬细胞摄入的透过性标记的量，将所述量作为b)中的吞噬细胞活力的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照增加，表明细胞活力增强且测试化合物能抑制LukAB介导的细胞毒性，或c')检测吞噬细胞的膜损伤，将其作为不透过性标记的量的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照减少，表明所述测试化合物抑制LukAB介导的细胞毒性。9.鉴定LukA与人吞噬细胞结合的抑制剂的方法，所述方法包括a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物相接触，随后在允许LukA与吞噬细胞结合的条件下加入带...
【专利技术属性】
技术研发人员：V·J·托雷斯，A·L·杜蒙特，
申请(专利权)人：纽约大学，
类型：
国别省市：
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