本发明专利技术涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明专利技术涉及一种蜡蚧菌发酵生产蛋白酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有麦芽糖或者葡萄糖1w%，蛋白胨或者酵母粉1w%，Fe2+或者Mg2+4×10-4mol/L，VB6或者VC0.01%，培养基初始pH=6.0-9.0。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为100mL，接种量5mL，于26℃，转速160r/min下培养。本发明专利技术的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜡蚧菌发酵生产蛋白酶的培养基，具有蛋白酶产率高，蛋白酶活力高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本专利技术涉及一种蜡蚧菌{LecaniciIlium)发酵生产蛋白酶的培养基及方法。
技术介绍
蛋白酶是一类可以催化蛋白质水解反应的酶，它广泛存在于各种生物体中，不仅对生物体蛋白质的新陈代谢起调节作用，从细胞水平、器官水平和机体水平，呈现多种多样的功能。它们参与细胞的正常生理以及异常的病理条件下的诸如蛋白质水解、细胞生长和迁移、酶原激活、激素释放等各种复杂的过程(汪章勋等，2005)。蛋白酶在食品、化工、医疗、农业、环保等许多方面发挥重要的作用，例如可用做生物农药的虫生真菌，其蛋白酶活力与其毒力密切相关(Paoletti M, 200)。 腊阶菌cillium)隶属丝孢菌类(Hyphomycetes),广泛分布于热带、亚热带和温带，能寄生蚧类、蚜虫类、螨类和粉虱，还可寄生鳞翅目的一些害虫及线虫、蓟马等。20世纪70年代以来，欧洲一些国家及美国、日本等国对利用蜡蚧菌防治温室蔬菜害虫给予极大重视。用蜡蚧菌发酵生产蛋白酶酶可为将来真菌防治害虫的深入研究提供科学依据。昆虫的体壁主要是由蛋白基质和分布其中的几丁质组成，蛋白质的类型和数量在不同种类的昆虫组织和生长阶段中是不断变化的，为了能穿透这种复杂而多变的结构，昆虫病原真菌能分泌一系列不同的体壁降解酶类，包括脂酶、几丁质酶、蛋白酶等(杨晓昱等，2005)。可产生蛋白酶的微生物种类尤其多，包括细菌、真菌和病毒。由于微生物蛋白酶比植物蛋白酶和动物蛋白酶更容易获得，而且微生物蛋白酶来源丰富。所以，微生物蛋白酶越来越成为近年来蛋白酶的研究热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术首先提供了一种蜡蚧菌发酵生产蛋白酶的培养基，所述培养基的原料含有麦芽糖或葡萄糖10g/L，蛋白胨或酵母粉10g/L，Fe2+或Mg2+4X Krtiol/L，Vb6或VeO. lg/L，培养基初始PH= 6. 0-9. O。更优选地，所述培养基的原料含有麦芽糖10g/L，蛋白胨I Og/L，Mg2+4X10_4mol/L，VB6 0.1 g/L，培养基初始 pH= 6. O。本专利技术还提供了一种蜡蚧菌发酵产蛋白酶的方法，所述方法包含以下步骤 (a)将蜡蚧菌接种种子培养基，制得发酵种子液； (b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为IOOmL,接种量5mL，于26°C，转速160 r/min下培养。所述种子培养基的原料配方为200g/L土豆,葡萄糖20g/L,其余为水，自然pH。本专利技术采用的蜡蚧菌为蜡蚧菌Z.1ecanii FJ28 (邱君志等，金属离子对蜡蚧菌几丁质酶活力的影响，激光生物学报，2009年2月)。采用本专利技术优化后的培养基，菌龄7d，发酵周期5d，发酵产生结果蜡蚧菌FJ28产蛋白酶为50U/mL以上。本专利技术的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜡蚧菌发酵生产蛋白酶的培养基，具有蛋白酶产率高，蛋白酶活力高等优点。附图说明图1酪氨酸溶液的标准曲线。图2碳源对产蛋白酶的影响。图3氮源对产蛋白酶的影响。 具体实施例方式本专利技术用下列实施例来进一步说明本专利技术，但本专利技术的保护范围并不限于下列实施例。实施例1 单因素实验确定培养基最优成分 (I)种子培养基和基础培养基配制 (a)20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含150mL。1. OlMPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。(b)基础培养基(液体诱导培养基)0. 5% 明胶、1. l%Na2HP04° 12H20、1. 2%NaH2P04。2H20^ pH6. 50(2)发酵种子的制作将蜡蚧菌FJ28接种于马铃薯琼脂培养基上，于26°C下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，26°C，转速160 r/min下培养10d，即为发酵液。(3)酶液的制备取步骤(2)下的发酵液在4°C下，5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在波长275nm处的吸光值。换算成酶活单位U/mL。(4)蛋白酶酶活测定取Iml酶液在60°C水浴5min，加入三氯乙酸摇匀，将其放入40°C水浴IOmin,再加酪素Iml静置IOmin过滤,定容至IOml,作为对照。再取Iml酶液加酪素Iml在40°C水浴IOmin,加入三氯乙酸2ml摇勻静置IOmin过滤,定容至IOml,在275nm波长下测紫外吸光度。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A为样品的吸光度；K为吸光常数为反应试剂的总体积；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL)。(5)标准曲线的制作在0-100iig/mL范围内，以275nm处的吸光值为横坐标(X)、酪氨酸的浓度为纵坐标(Y)制定标准曲线。具体步骤如下 a.用超纯水配置浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 u g/mL的酪氨酸。b.测定反应液在275nm处的吸光值，在上述反应体系中以超纯水取代酪氨酸为空白对照。试验设置3个重复，其平均值用于制作标准曲线。结果见图1。(6)不同碳源、氮源、维生素对产蛋白酶的影响 Ca)碳源对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加1%麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、麦麸、玉米粉、甘油、D-山梨醇、可溶性淀粉，接入相同的蜡蚧菌液，在26°C、160r/min的摇床中培养，每天检测发酵液中蛋白酶活性。以基础液体培养基的蛋白酶活力作为对照，根据实验数据选择对产酶最有利的碳源。结果见图2。(b)氮源对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加1%的蛋白胨、酵母粉、NH4HCO3、KNO3、NH4Cl、Ca (NO3) 2、，接入相同的蜡蚧菌液，在26°C、160r/min的摇床中培养，每天检测发酵液中蛋白酶活性。以基础液体培养基的蛋白酶活力作为对照，根据实验数据选择对产酶最有利的氮源。结果见图3。 实验结果 添加不同碳源(麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、麦麸)均提高了酶活性。其中添加麦芽糖使杀虫蜡蚧菌FJ28在接种后第2d就出现蛋白质酶高峰并且蛋白酶活性达到47. 92U/mL ;其次是添加葡萄糖的处理，在接种后第2d产酶达到30. 78U的高峰；添加葡萄糖、麦麸的处理相对前两者其产酶活性要低点。因此，不同碳源对蜡蚧菌FJ28产酶量影响不同。由此可见，麦 芽糖是促进蜡蚧菌FJ28产蛋白酶的最佳碳源。在所添加的不同氮源中，添加蛋白胨的处理最有助于提高产酶水平，在接种后的第3d就出现产蛋白酶高峰，其酶活性达到16. 44U/mL，而添加酵母浸粉、KNO3等的处理都没蛋白胨处理的酶活高。此外，从提升蛋白酶活性总体上看有机氮优于无机氮。据此，蛋白胨是提高蜡蚧菌FJ28产蛋白酶的最佳氮源。实施例2 正交实验确定最优发酵条件 (I)正交实验确定最佳培养基 在前期单因素实验的基础上，分别选取4种较适合该菌产蛋白酶的l%(w/v)碳源(麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、麦麸)、1%氮源(NH4HC03、酵母粉、蛋白胨、NH4Cl)、4X10_4mol/l金属离子(Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+)、0. 01% 维生素(V本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蜡蚧菌发酵生产蛋白酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有麦芽糖或葡萄糖10g/L，蛋白胨或酵母粉?10g/L，Fe2+或Mg2+4×10?4mol/L，VB6或VC0.1g/L，培养基初始pH=?6.0?9.0。
【技术特征摘要】
1.一种蜡蚧菌发酵生产蛋白酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有麦芽糖或葡萄糖10g/L，蛋白胨或酵母粉10g/L，Fe2+或Mg2+4X ΙΟΛιοΙ/Ι，Vb6或VeO. lg/L，培养基初始 pH= 6. 0-9. O。2.—种蜡蚧菌发酵生产蛋白酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有麦芽糖10g/L，蛋白胨 I Og/L，Mg2+4X lO-W/L，VB6 0.1 g/L，培养基初始 pH= 6. 0。...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱君志，苏礼超，涂洁，宋飞飞，邱云锋，李小霞，何肖云，毛丽慧，谢小聪，张伟，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
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