一种ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株及其构建方法，所述细胞株为能稳定表达光敏感蛋白（ChR2）和绿色荧光蛋白（GFP）的重组C17.2神经干细胞株；通过构建重组慢病毒、转导C17.2神经干细胞株以及筛选获得重组ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株；本发明专利技术的细胞株可用于移植干细胞分化来源的神经元与宿主神经系统功能整合的在体及离体研究，为干细胞移植后分化来源的神经元与宿主神经系统功能整合的研究提供一个良好的平台；本发明专利技术构建重组干细胞方法，尤其是利用滤纸片消化法，提高了GFP阳性细胞的比率，有利于流式FACS分选，大大提高了实验效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及。
技术介绍
神经系统变性疾病是一类疾病，包括帕金森、阿尔茨海默等疾病，目前尚无有效、特异疗法，干细胞移植替代疗法具有良好的前景。移植入体内干细胞来源的神经元必须能与宿主神经系统存留的神经元之间建立有功能的突触联系，才能恢复突触信息的传递。目前的多种研究只是在形态学方面提供了间接证据，尚未在功能上尤其是传递信息的突触层面阐明该问题。光遗传学技术的发展可以解决该问题。利用遗传学技术使细胞表达光敏感蛋白，可实现对细胞功能的光学控制，斯坦福大学的Deisseroth教授等将这种结合光学和遗传学结合的技术称为光遗传学技术。光敏感蛋白是能够被光激活的一类膜蛋白，广泛分布于原核生物、植物以及动物的视觉系统中，目前在光控神经元研究中广泛应用的是光敏感蛋白(Channelrhodopsin-2,简称ChR2)。ChR2是从单细胞绿藻中分离出来的一种感光性膜表达阳离子通道蛋白，能够通过基因转染技术表达在神经元的细胞膜上，当在低能量470nm蓝光瞬间(5-15ms)照射下，ChR2通道打开，Na+、Ca2+等阳离子进入胞内引起细胞去极化从而产生动作电位，而且不会影响本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ChR2?GFP基因工程化神经干细胞株，其特征在于：所述细胞株为能稳定表达光敏感蛋白（ChR2）和绿色荧光蛋白（GFP）的重组C17.2神经干细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株，其特征在于所述细胞株为能稳定表达光敏感蛋白(ChR2)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组C17. 2神经干细胞株。2.—种构建权利要求I所述的ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株的方法，其特征在于包括如下步骤 第一步，重组慢病毒的构建和筛选 接种293FT细胞于加有10%FBS+DMEM培养基的24孔板中，每孔细胞接种细胞数为I X IO5个，然后用慢病毒包装质粒混合物和ChR2-GFP慢病毒表达质粒共转染所述293FT细胞,24小时换为含1%FBS DMEM培养液，48小时5000rpm离心5min收集培养液上清，O. 45 μ m的PVDF膜过滤所述上清得重组慢病毒液。以标准病毒液I X IO8Cfu / L为对照，将所述重组慢病毒液和标准病毒液按感染复数值分别设5个梯度1、3、5、10和20，感染293FT细胞并于24小时后根据绿色荧光细胞的强度和数量确定病毒滴度，当表达GFP的细胞超过95%、慢病毒液滴度达I. OX IO8Cfu / L的重组慢病毒液用于下一步实验。第二步，重组C17. 2神经干细胞株的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：王少军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：