一种提取虫草素的方法技术

本发明专利技术属于医药领域，具体涉及一种提取虫草素的方法。将蛹虫草固体培养残基或菌体样品经粉碎，与水混合，浸提即为粗提液；或蛹虫草液态培养发酵液过滤后，即得粗提液；将上述所得粗提液过滤后，待用；将上述所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，而后依次用水、甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生；将所得粗虫草素采用高效液相色谱进行纯化，即得到纯度约95％的虫草素。本发明专利技术是一个低污染的绿色环保化工生产过程；制备过程是在常温下完成的，节省了大量能源；产品纯度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药领域，具体涉及ー种提取虫草素的方法。
技术介绍
冬虫夏草，又名中华虫草，也称为夏草冬虫，简称虫草。是中国传统的名贵中药材，它是由肉座菌目麦角菌科虫草属的冬虫夏草菌寄生于高山草甸土中的蝠蛾幼虫，使幼虫僵化，在适宜条件下，夏季由僵虫头端抽生出长棒状的子座而形成(即冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核(幼虫尸体)构成的复合体)。然而，世界性冬虫夏草分布天然资源数量很少，在我国，冬虫夏草种类虽然很多，达数百种，但是入药的就只有两种冬虫夏草菌，北冬虫夏草菌。 蛹虫草(Cordyceps militaris)即北冬虫夏草菌,为子囊菌亚门，麦角菌科、虫草属的模式种。又名北虫草、虫草等。中医认为，虫草入肺肾ニ经，既能补肺阴，又能补肾阳，是唯一的ー种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代医药学研究表明蛹虫草富含虫草酸、虫草素、多糖、S0D、硒等多种生物活性物质。其中虫草素是ー种具有抗菌活性的核苷类物质，对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。尤其值得关注的是，美国NCI (国家癌症研究所)对虫草素的开发已经进入临床实验阶段，显示出很好的临床效果和市场前景。随着我国蛹虫草种植业规模的不断扩大，市场竞争激烈，利润空间变小。依靠出售北虫草子实体初级产品的盈利模式技术附加值低，导致缺乏核心技术支撑的虫草种植业很难取得可持续性的发展。而且随着产业规模持续扩大带来经济效益的同时也产生了一个严重的问题，即大量虫草采收后的废弃培养基的处置。培养残基(湿)与采收后用于出售的虫草子实体部分(干)达10 I左右。2010年仅沈阳市的虫草培养基实际排放量已达I万吨。随意排放的培养残基仍然可作为霉菌等有害真菌的优良生长基质，从而造成有害真菌的恶性生长，形成培养残基废料的腐败发霉而产生大量悬浮于空气中的孢子以及可污染地下水的真菌毒素(如强致癌性的黄曲霉素等)物质，不仅会威胁生态安全还能够直接威胁人类的健康。此外，当前虫草种植户将培养残基倾倒于低洼地或沟渠内，然而随着长期大量的排放，很多地方出现了虫草废料围村甚至出现虫草废料无处处置的窘境。严重影响了该产业的可持续性发展，也对生态环境造成了不同程度的破坏。已经报道的提取虫草素的技术主要采用了较传统的离子交換、沉淀蛋白、有机溶剂脱脂、热提取、重结晶、醇沉淀等繁琐且低效的技木，不仅带来酸、碱、有机溶剂等污染物的排放，还增加了能源的消耗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为(I)虫草素粗提液的制备蛹虫草固体培养残基或菌体样品经粉碎，与水混合，浸提即为粗提液；或蛹虫草液态培养发酵液过滤后，即得粗提液；将上述所得粗提液过滤后，待用；(2)粗虫草素的富集将上述步骤I)所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，而后依次用水、甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生；(3)虫草素的纯化将步骤2)所得粗虫草素采用高效液相色谱(HPLC)进行纯化，根据不同的色谱条件即采用不同的色谱柱规格、流速和洗脱液，收集相应的主色谱峰，即得虫草素。所述步骤(I)中蛹虫草固体培养残基或菌体样品粉碎后与水按体积比I : 8-30的比例混合，混合后经15-50°C浸提2-36小时，浸提后过滤，滤渣重复上述提取2-3次，将所·得滤液合并，得粗提液。所述步骤(I)中蛹虫草固体培养残基或菌体样品粉碎后水按体积比与I : 10-20的比例混合，混合后在室温下浸提12-24小时，浸提后过滤，滤渣重复上述提取2-3次，将所得滤液合并，得粗提液。所述步骤(I)中蛹虫草固体培养残基或菌体样品粉碎后水按体积比与I : 20的比例混合，混合后在室温下浸提24小时，浸提后过滤，滤渣重复上述提取I次，将所得滤液合并，得粗提液。所述步骤2)中将上述步骤I)所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，每升滤液添加20-60g的填料，而后依次用5-15个柱体积的水、5-15个柱体积的甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生；所述甲醇水溶液为体积百分比5-30%的甲醇水溶液；DS填料粒径小于等于150 μ m。所述步骤2)中将上述步骤I)所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，每升滤液添加30-50g的填料，而后依次用8-12个柱体积的水、8-13个柱体积的甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生；所述甲醇水溶液为体积百分比5-20%的甲醇水溶液；0DS填料粒径小于等于75 μ m。所述步骤2)中将上述步骤I)所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，每升滤液添加40g的填料，而后依次用8-12个柱体积的水、9-13个柱体积的甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生；所述甲醇水溶液为体积百分比10-20%的甲醇水溶液；0DS填料粒径 40-60 μ m。所述步骤2)中将上述步骤I)所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，每升滤液添加40g的填料，而后依次用9个柱体积的水、11个柱体积的甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生；所述甲醇水溶液为体积百分比10%的甲醇水溶液；0DS填料粒径50μπι。所述步骤3)高效液相HPLC柱进行纯化条件，检测波长为220-300nm，流动相为5-50%甲醇水溶液。所述步骤3)高效液相HPLC柱进行纯化条件，检测波长为220和/或260nm，流动相为10-25%甲醇水溶液。所述步骤3)高效液相HPLC柱进行纯化条件，检测波长为220和/或260nm，流动相为15%甲醇水溶液。本专利技术的优点本专利技术制备过程的关键技术环节不涉及热提取及有毒溶剂的使用，也不涉及传统方法使用的强酸强碱类物质，是ー个低污染的生产过程；制备过程是在较低的温度下完成的，节省了大量能源；产品纯度高(约95%)。具有环保和节能的双重意义，并为高质量的虫草素生产带来显著经济效益和社会效益。本专利技术采用膜过滤结合制备级ODS反相色谱的方法具有分离效果好、重现性高。本专利技术提取虫草素的来源可以是蛹虫草培养残基、蛹虫草菌体如子实体或液态发酵的菌丝体或者发酵液。从培养残基中获取高附加值的虫草素还可减少环境污染、带动虫草产业的不断升级。附图说明图I为本专利技术实施例提供的提取得到虫草素的HPLC色谱图，(I为虫草素，纯度 95. I % ;HPLC 色谱条件洗脱程序0-5min 2% 甲醇，5-10min2_12 % 甲醇，10_12min12-15%甲醇，12-30min 15%甲醇；检测波长260nm ;柱温30°C ;流速lmL/min ;色谱柱YMC ODS-A(10 X250mm,5 μ m))。··具体实施例方式下面的实施例将对本专利技术予以进ー步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例I :蛹虫草培养残基中虫草素的制备粗提液的制备取蛹虫草培养残基500g，粉碎成颗粒状，用蛹虫草培养残基20倍质量的水于室温下浸泡提取24小时，过滤，得滤液备用；滤渣再按上述方法提取I次，其中浸提时间为12小时，合并滤液得粗提液。粗提液的膜过滤分离粗提液采用中空纤维超滤设备截留分子量IOK以上的大分子物质得超滤液。粗虫草素的富集超滤液用反相键合相ODS填料柱(粒径50 μ m，径高比为I : 3)进行洗脱，每升超滤液中添加填料40g ;超滤液以加样流速2CV/h(CV :柱体积)上样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取虫草素的方法，其特征在于：(1)虫草素粗提液的制备：蛹虫草固体培养残基或菌体样品经粉碎，与水混合，浸提即为粗提液；或蛹虫草液态培养发酵液过滤后，即得粗提液；将上述所得粗提液过滤后，待用；(2)粗虫草素的富集：将上述步骤1)所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，而后依次用水、甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生；(3)虫草素的纯化：将步骤2)所得粗虫草素采用高效液相HPLC柱进行纯化，即得虫草素。

【技术特征摘要】
1.一种提取虫草素的方法，其特征在于 (1)虫草素粗提液的制备蛹虫草固体培养残基或菌体样品经粉碎，与水混合，浸提即为粗提液；或蛹虫草液态培养发酵液过滤后，即得粗提液；将上述所得粗提液过滤后，待用； (2)粗虫草素的富集将上述步骤I)所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，而后依次用水、甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生； (3)虫草素的纯化将步骤2)所得粗虫草素采用高效液相HPLC柱进行纯化，即得虫草素。2.按权利要求I所述的提取虫草素的方法，其特征在于所述步骤(I)中蛹虫草固体培养残基或菌体样品粉碎后与水按体积比I : 8-30的比例混合，混合后经15-50°C浸提2-36小时，浸提后过滤，滤渣重复上述提取2-3次，将所得滤液合并，得粗提液。3.按权利要求2所述的提取虫草素的方法，其特征在干所述步骤(I)中蛹虫草固体培养残基或菌体样品粉碎后水按体积比与I : 10-20的比例混合，混合后在室温下浸提12-24小时，浸提后过滤，滤渣重复上述提取2-3次，将所得滤液合并，得粗提液。4.按权利要求3所述的提取虫草素的方法，其特征在干所述步骤(I)中蛹虫草固体培养残基或菌体样品粉碎后水按体积比与I : 20的比例混合，混合后在室温下浸提24小时，浸提后过滤，滤渣重复上述提取I次，将所得滤液合并，得粗提液。5.按权利要求I所述的提取虫草素的方法，其特征在干所述步骤2)中将上述步骤I)所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，每升滤液添加20-60g的填料，而后依次用5-15个柱体积的水、5-15个柱体积的甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生； 所述甲醇水溶液为体积百分比5-30%的甲醇水溶液；DS填料粒径小于等于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，胡江春，樊玉清，何长江，樊杰，何忠彦，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：