本发明专利技术公开了一种快速测定三七愈伤组织中皂苷含量的方法，该方法通过对三七愈伤组织的皂苷进行提取，然后采用香草醛-冰乙酸显色法对皂苷提取液直接进行显色反应，最后采集数据，并进行光谱数据分析和处理，得到愈伤组织中皂苷含量；本发明专利技术方法操作简便、效果良好，可以实现三七总皂苷含量的快速检测，适用快速了解和认识三七培养细胞中总皂苷的含量，也可推广用于三七药材中皂苷含量的测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
三Al\_Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen]为五加科人参属植物,根和根莖入药，是云南的道地药材。三七做为传统中药已有悠久的应用历史，清代药学著作《本草纲目拾遗》中记载“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药之最珍贵者”。三七具有活血和止血的双重功效，是驰名中外的“云南白药”的重要成分。三七主产于我国云南省文山州，均为栽培品，全世界98%的三七原药材产于云南。 三七阜苷(saponins of Panax notoginseng, PNS)是三七的主要药用成分，由多种达玛烷型四环三萜皂苷组成，未发现含有齐墩果酸型皂苷，这与人参和西洋参有显著区另IJ。三七在防治心脑血管疾病方面表现出安全、可靠的疗效，以三七皂苷为主要活性成分的药品市场已达20亿人民币/年。三七为多年生草本植物，一般需种植3年以上方可入药，较长的生长周期、苛刻的生境要求以及巨大的市场需求导致药材供需矛盾日益凸显。2012年的三七药材价格已经是2008年的5倍。传统的药材栽培已很难满足日渐增加的市场需求，迫切需要采用现代生物技术手段解决三七药材短缺问题。其中最有效而直接的方法就是通过体外培养三七愈伤组织获得三七总皂苷。三七总皂苷含量测定的传统过程为乙醇或甲醇粗提皂苷，然后过大孔树脂进行纯化，除去多糖等杂质，最后采用香草醛-冰乙酸显色法，根据550 nm的吸光度值确定三七总皂苷的含量。该方法准确可靠，但需要用到柱层析操作，费时费力。本专利技术简化了三七皂苷含量测定方法，对粗提皂苷进行直接显色反应，大大简化了操作步骤。该检测过程采用化学计量学方法综合分析多波长数据，引入多波长为自变量，可排除杂质干扰影响，实现三七愈伤组织中的三七总皂苷含量的测定。该法操作简便，准确性高，具有较好的实用性和可推广性，国内外未见相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速检测三七愈伤组织中皂苷含量的方法。该方法的操作步骤如下 1)三七愈伤组织的皂苷提取精确称取干燥至恒重的三七愈伤组织粉末，置于洗净的三角瓶中，按I g样品加入50-70 mL甲醇，采用常规的有机溶剂提取法对三七愈伤组织粉末进行常温超声波处理1-2 h，过滤，收集滤液，将滤液挥干后再用甲醇溶解，定容至超声提取时溶液体积的二分之一，即得到提取液； 2)三七皂苷含量测定精确吸取上步获得的提取液样品300UL至带塞的10 mL试管中(设3个重复)，水浴(温度低于55°C )挥干溶剂，加入新配制的香草醛-冰乙酸(1:20，v/V)溶液0. 2 mL,高氯酸0. 8 mL,混勻后60°C以下水浴加热15 min (过程中适当震荡使其反应充分)，立即用冰水冷却，加入5mL冰乙酸，混匀静置10 min后对显色液进行400-700 nm区间的吸光度扫描； 3)光谱数据分析和处理，采用化学计量学中的偏最小二乘法处理步骤2)中获得的吸收光谱数据，数据采集范围530-570 nm，基于可见光区的吸收光谱数据，建立测定三七总皂苷含量的回归方程，应用回归方程计算样品中三七总皂苷的含量。以上专利技术方法没有复杂的样品前处理和分离纯化过程，可在短时间内实现三七愈伤组织中三七皂苷含量的快速检测，方便实用。当提取液中皂苷含量大于5 mg/L时，该专利技术方法的检测误差可小于1%，表明该方法具有较高的测量准确性，可满足三七皂苷的含量检测需求。目前，国内外还未见有关三七愈伤组织中皂苷简便、快速测定的相关报道。具体实施方式 下面通过实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容。实施例I :快速测定三七愈伤组织皂苷含量的方法，具体操作如下 1)三七愈伤组织的皂苷提取精确称取干燥至恒重的三七愈伤组织粉末Ig，置于洗净的100 mL三角瓶中，加入50 mL甲醇常温超声波处理lh，过滤，收集滤液，将滤液挥干后再用甲醇溶解，定容至25 mL,即得到提取液； 2)三七总皂苷含量测定精确吸取上步获得的提取液样品300UL至带塞的10 mL试管中(设3个重复)，水浴(温度50 °C)挥干溶剂，加入新配制的香草醛-冰乙酸溶液(1:20，v/v)0. 2 mL，高氯酸0.8 mL，混匀后55 1水浴加热15 min (过程中适当震荡使其反应充分)，立即用冰水冷却，加入5 mL冰乙酸,混匀静置10 min后对显色液进行400-700 nm区间的吸光度扫描； 3)光谱数据分析和处理采用化学计量学中的偏最小二乘法处理步骤2)中获得的吸收光谱数据，数据采集范围545-555nm，基于可见光区的吸收光谱数据，建立测定三七总皂苷含量的回归方程，本实施例中建立的回归方程为Y=1037. 7672+2215242. 4517x「2794868. 9232 x2-2740603. 4293x3+2034602. 7140 x4+4499565. 2244 x5_528134.5510 x6_4013518.1178 x7_1818522. 0241x8+1572072. 7991 x9+5058327. 3974 x10-3488339. 6909 X11 其中Y表示三七总皂苷的含量，X1-X11代表吸收光谱图中545-555 nm波长范围内每间隔I nm的吸光度数值，例如X1和X11分别是545 nm和555 nm下的吸光度值，用该回归方程对8个样品中三七总皂苷含量进行预测，结果如表I所示。表I样品中三七总皂苷含量真实值和回归方程预测值比较择号I真实值(Pg/mL)I预测值(Pg/mL)|预测相对误差 1115.2~ 116.00.69% 287.2~86.9-0. 38% 396.9~96.90.01% 4101. 9— 101. 7-0. 17% 583.9~83.4-0. 58% 698. I~98.40.26% 7160.4— 160. I-0. 17% 8~丨54. 2丨54. 4|o. 34%如表I所示，选取545-555 nm下的吸光度数据，利用偏最小二乘法获得回归方程，预测值和真实值相对误差小于1%，可以用该方程准确测定体系中三七总皂苷的含量。 实施例2 :快速测定三七愈伤组织皂苷含量的方法，具体操作如下 I)三七愈伤组织的皂苷提取精确称取干燥至恒重的三七愈伤组织粉末I g左右，置于洗净的200 mL三角瓶中，加入70 mL甲醇常温超声波处理I h，过滤，收集滤液，将滤液挥干后再用甲醇溶解，定容至35 mL,得提取液。2)三七总皂苷含量测定精确吸取上步获得的提取液样品300 u L至带塞的10mL试管中(设3个重复)，水浴(温度50 °C)挥干溶剂，加入新配制的香草醛-冰乙酸溶液(1:20, v/v)0. 2 mL，高氯酸0.8 mL，混匀后55 1水浴加热15 min (过程中适当震荡使其反应充分)，立即用冰水冷却，加入5 mL冰乙酸，混匀静置10 min后对显色液进行400-700nm区间的吸光度扫描； 3)光谱数据分析和处理。采用化学计量学中的偏最小二乘法处理步骤2)中获得的吸收光谱数据，数据采集范围530-544nm，基于可见光区的吸收光谱数据，建立测定三七总皂苷含量的回归方程。本实施例中建立的回归方程本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速测定三七愈伤组织皂苷含量的方法，其特征在于该方法的操作步骤包括：1）采用常规的有机溶剂提取法对干燥至恒重的三七愈伤组织粉末进行常温超声处理1？2？h，过滤，滤液挥干后用甲醇溶解，定容至超声提取时溶液体积的二分之一，即得到提取液；2）采用香草醛？冰乙酸显色法对皂苷提取液直接进行显色反应；3）显色液进行400？700？nm区间的吸光度扫描，数据采用化学计量学中的偏最小二乘法处理步骤2）中获得的吸收光谱数据，数据采集范围530？570？nm，根据不同波长条件下的吸光度值，建立基于多自变量的用于测定三七总皂苷含量的回归方程，应用回归方程计算样品中三七总皂苷的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：葛锋，于钢，刘迪秋，陈朝银，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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