本发明专利技术公开了一种抑制水牛骨形态发生蛋白15（bonemorphogeneticprotein15，BMP15）基因表达的siRNA，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所述的siRNA正义链具有SEQIDNO:1~3所示的任一序列。本发明专利技术还公开了含有该siRNA的shRNA编码基因及由其构建的慢病毒干扰质粒pshRNA-copGFPLentivector。通过实时定量Real-timePCR检测发现，各siRNA片段分别能使水牛BMP15mRNA表达量降低29.25%，57.75%，82.5%；ELISA检测BMP15蛋白表达量也相应降低。本发明专利技术的siRNA片段及其表达载体可用于制备抑制水牛BMP15表达的制剂，能够显著下调BMP15基因的表达量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学以及生物工程
，具体涉及水牛抑制骨形态发生蛋白15（BMP15）基因表达的siRNA片段。
技术介绍
1998年，华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次发现RNA干扰(RNA interference，RNAi)， RNAi是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子引发的转录后基因沉默过程，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNAi是通过双链RNA诱导与之同源的mRNA降解，导致目标基因转录后缄默的现象或机制。 siRNA是RNAi机制中最重要的发现。生物学研究证实，siRNA为3′端突出2-3nt，长为19-23 nt的双链RNA，5′端为磷酸基，3′端为羟基，这种结构特点说明dsRNA被与RNaseIII相似的酶加工过。RNA干扰包括起始阶段和效应阶段 (initiation and effecting steps)。在起始阶段，加入的双链RNA被切割为21-23个核苷酸的小分子干扰RNA (small interfering RNAs，siRNA)。研究表明:Dicer酶是RNaseIII家族中能特异识别双链RNA的一种，它以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA，将dsRNA降解为21bp左右的双链RNA，每个片段的3′端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。 激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，mRNA与siRNA的反义链结合，置换出正义链，然后RISC上的核酸酶以一定的间隔，在被识别的2个核酸中间进行切割，以核酸内切酶作用方式对mRNA进行核酸内切割，导致mRNA降解。完成一次切割后，引导siRNA仍然结合在RISC中，继续完成更多轮的切割。在线虫和植物研究中发现，RdRP会以mRNA为模板，siRNA为引物，产生更多的dsRNA，进而将RNAi效应放大。 目前siRNA的导入方式有三种，第一种是化学合成siRNAs转染干扰，第二种是shRNA表达载体法，第三种是病毒载体法。慢病毒载体能在哺乳动物各类细胞稳定表达shRNA，长期抑制基因表达，被认为是目前活体RNAi的最佳载体。慢病毒载体介导的RNA干扰，就是将慢病毒载体高效感染和整合的特性与RNA干扰特异性抑制同源基因表达的作用相结合。2007年Singer等利用表达来源与聚合酶III启动子的短发夹RNAs (shRNAs)慢病毒成功制备了转基因敲除小鼠。 BMP15最初是由Wozney于1988年首次分离到BMP15并成功克隆全cDNA。从氨基酸的序列看，BMP15和其它的BMPs一样属于转移生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)超家族成员。许多研究表明，BMP15与很多BMPs一样在动物的生殖调节中发挥着重要的作用。BMP15是一种在卵巢表达的卵母细胞衍生因子，在正常情况下主要与卵巢自身产生的GDF9协调作用于卵泡，以自分泌或旁分泌形式影响优势卵泡的发育及卵母细胞的生长。BMP15是啮齿类动物、羊和人卵泡发育过程中必不可少的调节因子，而且还参与调节绵羊排卵率。另外，BMP15除在卵母细胞的特异表达，还在哺乳动物其它组织表达。Otsuka等报道，小鼠的垂体中发现有BMP15的表达。Aahonen等报道，在人睾丸中有BMP15的表达。Pennetier等利用 RT- PCR技术证实了BMP15在牛睾丸中有表达。Faure等报道，人的垂体、子宫和骨髓都有BMP15的表达。何小龙等的研究表明，BMP15基因能够在蒙古牛卵巢、输卵管、子宫和肾脏组织中表达，并且在卵巢和输卵管中高度表达， 而在子宫和肾脏组织中表达水平不是很高。因此，BMP15在调节哺乳动物生殖方面可能起着多重的调节作用。 siRNA作为一种新型的基因工具来抑制特定基因的表达，目前大规模应用于生物细胞、组织和个体，均取得了不同程度的预期效果。但对于水牛骨形态发生蛋白15的siRNA还未见研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过下调BMP15基因的部分功能来提高水牛的繁殖率，由于水牛繁殖率普遍较低，本专利技术提供了一种抑制水牛骨形态发生蛋白15（简称BMP15）基因表达的siRNA。 本专利技术通过以下技术方案实现上述目的： 一种抑制水牛骨形态发生蛋白15（简称BMP15）基因表达的siRNA，分别命名为BMP15-1、BMP15-2和BMP15-3，其核苷酸双链中正义链序列如下：BMP15-1： SEQ ID NO:1；BMP15-2： SEQ ID NO:2；BMP15-3： SEQ ID NO:3。所述siRNA与BMP15基因mRNA反向互补，其长度为19~27bp。 含有上述siRNA的shRNA。 上述shRNA，两端带有BamHⅠ和EcoR I酶切位点的序列，便于构建表达质粒，双链核苷酸序列如下： BMP15-1dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；BMP15-2dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；BMP15-3dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。一种表达载体，由上述shRNA的编码基因与出发载体构建的，即将shRNA编码基因插入出发载体上构建而成。 慢病毒载体可以直接高效率地感染分裂期和非分裂期细胞，且转染效果更加稳定，作为上述出发载体中的优选方案，其中病毒载体最优选pshRNA-copGFP Lentivector。该载体具有完整的shRNA插入位点以及绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）报告基因，实现了靶基因shRNA的高效表达、病毒包装以及转基因的直观展示。 本专利技术的siRNA可以制备成基因药物或其他合适的制剂用于下调水牛骨形态发生蛋白15的表达，从而提高水牛的繁殖性能。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果： 本专利技术的siRNA沉默效果好，能够特异性的下调BMP15基因的表达。通过实时定量Real-time PCR检测发现各干扰片段能使BMP15 mRNA表达量显著降低，ELISA检测BMP15蛋白表达量也相应降低。专利技术人构建了含有上述siRNA的编码基因的pshRNA-copGFP Lentivector 慢病毒干扰质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，并制备了转基因小鼠模型，结果证明了pshRNA-copGFP Lentivector 慢病毒干扰质粒转入细胞后能表达shRNA，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制水牛骨形态发生蛋白15基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链具有以下任一序列：BMP15？1：SEQ？ID？NO:1；BMP15？2：SEQ？ID？NO:2；BMP15？3：SEQ？ID？NO:3。
【技术特征摘要】
1.一种抑制水牛骨形态发生蛋白15基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链具有以下任一序列：
BMP15-1：SEQ ID NO:1；
BMP15-2：SEQ ID NO:2；
BMP15-3：SEQ ID NO:3。
2.一种shRNA，其特征在于含有权利要求1所述的siRNA。
3.如权利要求2所述的shRNA，其特征在于，是以下任一双链核苷酸序列：
BMP15-1dsDNA：正义链具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
BMP15-2dsDNA：正义链具有如SEQ ID N...
【专利技术属性】
技术研发人员：习欠云，张永亮，施振旦，肖敏，焦莉，石德顺，刘庆友，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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