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一种产牛磺酸菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产牛磺酸技术

技术编号:8410026 阅读:482 留言:0更新日期:2013-03-14 00:40
本发明专利技术阐述了一种产牛磺酸菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产牛磺酸,属于生物工程技术领域。本发明专利技术菌株首先将土壤经过沸水浴后稀释涂布,染色镜检获得有芽孢菌株,然后对筛选出的菌株采用一级发酵逐一摇瓶培养,发酵液中加入牛磺酸标准品作为内标,采用高效液相色谱法进行定性分析筛选,并对筛选菌株进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定,最终获得一株高产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。本发明专利技术同时公开一种采用该菌株生产牛磺酸的方法,采用本方法发酵72h牛磺酸产量为1g/L。

【技术实现步骤摘要】

—种产牛磺酸的枯草芽孢杆菌的筛选方法及应用该菌株生产牛磺酸,属于生物工程领域,特别是一株产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。
技术介绍
牛磺酸(Taurine)是动物体内的一种含硫氨基酸,又称牛胆碱、牛胆素,其化学结构式为H2N-CH2-CH2-SO3H,化学名称为2-氨基乙磺酸。它广泛分布于生物体内各组织、器官,主要以游离状态存在于组织间液和细胞内液中,因最先从牛胆汁中分离出来而得名。1954年Stern和Moore首次在脑和脊髓中发现了牛磺酸。但长期以来一直被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物。1976年Hayes等首次报道用以酪蛋白为主要蛋白来源但缺乏牛磺 酸的饲料喂猫,可引起猫的视网膜变性,若长时间缺乏,可使猫失明,从而引起了人们对牛磺酸营养作用的极大关注。研究发现,牛磺酸是调节机体正常生理活动的活性物质,具有维持正常视觉功能、维持机体渗透压平衡,调节细胞钙平衡,与细胞膜的流动性有关,降血糖、调节神经传导、参与内分泌活动、调节脂类消化与吸收、增加心脏收缩能力、提高机体免疫能力、增强细胞膜抗氧化能力、保护心肌细胞等广泛生物学作用。牛磺酸在临床上已被广泛应用于心血管疾病、高胆固醇血症、眼部疾病、糖尿病、早老性痴呆和肝病等一系列疾病的治疗。在食品领域,牛磺酸的已经成为多种食品营养强化剂和添加剂的主要活性成分,作为食品添加剂,其可被添加到乳制品、饮料、豆制品等食品中。目前,世界上牛磺酸的年消耗量已超过I. 5万吨/年,其中80%以上用作食品营养添加剂。我国生产的牛磺酸主要用于出口、医药以及食品,其中出口量约占90%,作为食品添加剂仅占6%,而美国仅在饮料食品中作营养强化剂一项消费就近每年I万吨。随着国内人民生活水平和健康意识的提高,牛磺酸作为营养保健品和强化食品添加剂将越来越受到人们的重视,市场需求趋旺,具有巨大的发展潜力和空间。由于牛磺酸在天然生物中较分散、量少,从天然生物品中提取的量也很有限。所以目前牛磺酸的获取主要还是靠化工合成。如利用2-溴乙胺氢溴酸盐与Na2SO3,反应制备牛磺酸,虽然产率较高,但成本很高,难以实现工业化,而使用低成本的合成方法如2-氯乙胺盐酸盐与Na2SO3反应,则收率较低。目前,牛磺酸的生产厂家主要集中在日本、美国、欧洲等发达国家和地区,我国牛磺酸生产工艺陈旧、成本高、产量低,与欧美等发达国家还有很大差距。早在1988年日本就有专利报道,可用发酵法制取牛磺酸,并同时报道了许多种类的微生物都能生产牛磺酸或其类似物。然而近几十年来,鲜有关于采用微生物发酵法生产牛磺酸的研究报道,仅在2009年Choi Y. J.等报道了采用代谢工程的方法在大肠杆菌中生产牛磺酸。对采用微生物发酵法生产牛磺酸的研究尚处于初步阶段,仍没用一种可以利用微生物发酵直接生产牛磺酸的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牛磺酸生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产牛磺酸。本专利技术的技术方案I、一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法I)枯草芽孢杆菌的初步分离纯化称取约O. 2g 土壤于20ml O. 85%无菌生理盐水中,将菌悬液在沸水中振荡加热IOmin后,迅速冷却至室温。此菌悬液作为母液梯度稀释至10_8,取10_6_10_8稀释菌液涂布于营养肉汤平板上,30°C倒置培养24h,挑取不同菌落形态的单菌落进行结晶紫染色,显微镜下观察芽孢,将有芽孢菌株作为进一步筛选的枯草芽孢杆菌疑似菌株,编号保存; 2)产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选将上述分离纯化得到的菌种接种于种子培养基中,然后转接到发酵培养基中,培养24h后离心收集发酵液,发酵液经高效液相方法中的内标法进行分析,使得牛磺酸标准品峰闻增闻的菌株即为广牛横酸的枯草芽抱杆菌。2、根据权利要求I所述一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法,其筛选得到产牛磺酸的枯草芽孢杆菌的鉴定方法如下I)形态学鉴定菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、芽孢染色;2)生理生化鉴定接触酶试验,V. P.及M. R.试验,明胶液化及淀粉水解,耐盐耐酸试验,硝酸盐还原试验;3) 16sRNA分子生物学鉴定用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组RNA,采用枯草芽孢杆菌16sRNA通用引物进行PCR扩增,扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化,连接至克隆载体PMD18T Vector,转化大肠杆菌JM109菌株,利用克隆载体的青霉素抗性筛选获得阳性转化子,并用通用引物对转化子进行质粒PCR鉴定。阳性克隆测序所得16sRNA序列与GenBank数据库中枯草芽孢杆菌的核苷酸序列进行同源性分析,其与枯草芽孢杆菌的同源性高达99%,结合形态学、生理生化等实验结果将该阳性克隆鉴定为枯草芽孢杆菌,并命名为B. subtilis FMME059。3、本专利技术公开的一种牛磺酸的生产方法,其特征是采用B. subtilis FMME059为出发菌株,以种子培养和液体发酵生产牛磺酸;I)种子培养种子培养基以g/L计葡萄糖40,胰蛋白胨20,KH2PO4L 5,K2HPO4,0. 5,MgSO4 · 7Η200· 5,生物素50,酵母膏5,尿素3,盐酸硫胺素10,初始PH 7. 2-7. 4 ;培养条件温度30°C、摇床转速200rpm条件下,培养18_20h ;2)液体发酵培养发酵培养基以g/L计葡萄糖20,酵母粉15,尿素15,KH2PO4L 5,K2HPO4L 5,MgSO4 · 7Η200· 4,MnCl2 · 4H20 MgSO4 · 7Η200· 2,硫酸铵 20,初始 PH 7. 2-7. 4 ;发酵条件接种量10%,温度30°C、摇床转速200rpm条件下,发酵72h。4、牛磺酸产量的测定根据牛磺酸和2,4- 二硝基氟苯(DNFB)进行衍生后在紫外360nm处有吸收峰,采用高效液相测定发酵液中的牛磺酸含量。发酵液的预处理取发酵液8000rpm离心IOmin,收集上清液,并加入15%的三氯乙酸沉淀发酵液中的蛋白(体积比I : 4),静置lh,8000rpm离心lOmin,取上清液。标准曲线的制作以商品牛磺酸(Sigma公司)作为标准品,配制1000、800、600、400、200mg/L的标准溶液。柱前衍生精密量取上述不同浓度的标准品和处理过的发酵液各lmL,分别置于 IOmL棕色量瓶中,依次加入O. 5mol/L的碳酸氢钠溶液ImL (取碳酸氢钠12g,用水溶解并稀释至250mL,用O. lmol/L氢氧化钠调节pH 9. O),I %的2,4 二硝基氟苯乙腈溶液O. 5mL,摇勻,置60°C水浴中避光加热Ih后取出,放冷至室温,加磷酸盐缓冲液(pH 7. 0,取磷酸二氢钾O. 68g,加O. lmol/L氢氧化钠溶液29. lmL,用水稀释至IOOmL,摇匀,即得)稀释至刻度,摇匀。用0. 22 μ m微孔滤膜过滤后,用高效液相色谱法测定牛磺酸的含量。经过柱前衍生处理,标准品都稀释到原来的10倍,所以标准曲线的最终梯度为100、80、60、40、20mg/L。发酵液经过除蛋白和柱前衍生处理,相当于稀释了 50倍。色谱条件色谱柱反相C18 柱 250mm X 4. 6mm,直径 5 μ m流动相磷酸盐缓冲液(pH8)乙腈(色谱纯)水=70 20 10柱温35°C;检测波长360nm;进样量20μ L流速lmL/min。标本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法,其特征为:1)枯草芽孢杆菌的初步分离纯化称取约0.2g土壤于20ml?0.85%无菌生理盐水中,将菌悬液在沸水中振荡加热10min后,迅速冷却至室温,稀释菌悬液涂布于营养肉汤平板上,30℃倒置培养24h,挑取不同菌落形态的单菌落进行结晶紫染色,显微镜下观察芽孢,将有芽孢菌株作为进一步筛选的枯草芽孢杆菌疑似菌株,编号保存;2)产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选将上述分离纯化得到的菌种接种于种子培养基中,然后转接到发酵培养基中,培养72h后离心收集发酵液,发酵液经过预处理后采用内标法经高效液相色谱进行定性分析,使得牛磺酸标准品峰高增高的菌株即为产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:吴静罗秋玲朱晓彤
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:

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