一种基于DNA折纸的生物分子亲和常数测定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA折纸的生物分子的亲和常数测定方法。所述生物分子包括能够彼此结合与解离的反应物Ⅰ和反应物Ⅱ，该方法包括（1）将反应物Ⅰ连接于DNA折纸订书钉链末端，然后和脚手架链进行自组装形成DNA折纸；（2）加入反应物Ⅱ，反应达到平衡后用原子力显微镜扫描成像收集数据，计算出反应物I和反应物Ⅱ复合物的浓度[AbAg]，游离反应物Ⅰ的浓度[Ag]以及游离反应物Ⅱ的浓度[Ab]；（3）将所得数据代入公式K=[AbAg]/[Ag][Ab]计算得到所述反应物Ⅰ和反应物Ⅱ的亲和常数K。该方法从分子水平精确计算所述生物分子的亲和常数，具有高效、重复性好和样品用量少的优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测方法领域，特别涉及一种基于DNA折纸的生物分子亲和常数的测定方法。
技术介绍
抗体的亲和力(affinity)是指抗原与抗体结合的牢固程度。亲和力越大表示抗体的结合反应越快，抗原抗体复合物越不易解离。抗体亲和力是抗体的结合部位与相应抗原决定簇之间的非共价引力与斥力之和，它是评价抗体质量的重要指标。抗体亲和力的大小以亲和常数表示，亲和力常数(K)是抗原/抗体结合反应的平衡常数。·目前，测定亲和常数的方法有多种，如硫氰酸盐洗脱法、尿素洗脱法、ELISA法、生物传感器法、表面等离子共振法和竞争结合法等。上述测定方法主要建立在宏观的统计数据基础上，目前还无单分子水平上的测定方法。亲和常数的测定是基于如下的结合解离作用定理，如下列化学式所示Ag — Ab反应达到平衡时，其亲和常数计算方法如下列数学式所示K= [AbAg] / [Ag] [Ab]其中，[Ag]代表游离抗原浓度，[Ab]代表游离抗体浓度，[AbAg]代表抗原抗体复合物浓度，K为亲和常数。传统的测定亲和常数的方法不能从上述数学式中直接测定亲和常数，因为无法确定反应中的游离抗原和游离抗体浓度，所以需变换公式进行测定。传统测定方法通常设定其中一组分浓度远远小于另外一组分浓度，如抗原浓度远远小于抗体浓度。这样，反应达到平衡时，就可以认为抗体总浓度为游离抗体浓度，带入变换后的公式计算。目前应用较多的测定生物分子亲和常数的方法主要为酶联免疫分析法(ELISA)和表面等离子体共振法(SPR)。ELISA是测定OD值来计算亲和常数，SPR是计算Kb (结合速率常数)和Kd (解离速率常数)来测定亲和常数K，这两种方法的背景噪声相对来说比都较大，测定过程也相对比较复杂。因此，传统的测定方法不仅需要消耗大量的抗原、抗体，而且实验设定的条件较多，步骤较繁琐而复杂，引入的误差也相对较大。DNA折纸术是最近几年得到迅猛发展的纳米技术，利用一条长的单链DNA (脚手架链，通常为M13mpl8)与相配对的200多条寡核苷酸链(订书订链)短链自组装而成。通过设计不同的寡核苷酸链，可使DNA组装成不同的纳米结构，其结构具有图案可控和编码可循的特征。由于个寡核苷酸链末端可被多种分子修饰，所以在DNA折纸界面上的反应位点具有精确可控的优势。原子力显微镜(AFM)具有纳米级的分辨率，通过检测折纸上特定位置的形貌变化就能够准确判断反应变化的情况，如反应是否发生，以及反应速度快慢等，能够在单分子水平上研究生物分子形貌和分子间相互作用力。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的生物分子亲和常数测定方法无法做到在单分子水平上进行测定，而且实验设定的条件较多，步骤繁琐而复杂，引入的误差也相对较大的问题，利用DNA折纸具有反应位点精确可控的优势以及原子力显微镜(AFM)可以在反应界面上直接观察单个抗原抗体分子复合物的优势，提供一种基于DNA折纸的生物分子的亲和常数测定方法。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之一是一种基于DNA折纸的生物分子的亲和常数测定方法，其中所述生物分子包括能够彼此结合与解离的反应物I和反应物II，该测定方法包括以下步骤(I)将反应物I连接于DNA折纸订书钉链末端，然后和脚手架链自组装形成DNA折纸；(2)加入反应物II，反应达到平衡后利用原子力显微镜扫描成像收集数据，计算出 反应物I和反应物II复合物的浓度[AbAg]，游离的反应物I的浓度[Ag]以及游离的反应物II的浓度[Ab]；(3)将步骤(2)所得数值代入如下公式,K = [AbAg]/[Ag] [Ab],计算得到所述反应物I和反应物II的亲和常数K。其中所述生物分子为本领域常规的单分子之间可发生结合与解离的一对生物分子。所述的生物分子较佳地包括反应物I和与之特异性结合的反应物II，所述反应物I和与之特异性结合的反应物II较佳地包括以下各组分子中的一组或多组抗原和抗体，生物素和亲和素，核酸适配体及其靶分子以及配体和受体。其中还包括已知的其他可以发生特异性结合并且具有亲和常数的物质，这些都在本专利技术的保护范围之内。例如可与DNA适配体或RNA适配体相结合的蛋白质、多糖和多肽等物质。本专利技术所述反应物I和反应物II优选地为地高辛和地高辛抗体。其中步骤(I)所述将反应物I连接于DNA折纸订书钉链末端，然后和脚手架链自组装形成DNA折纸的方法为本领域常规DNA折纸自组装方法。其中所述自组装方法较佳地包括以下步骤将修饰了反应物I的订书钉链与未修饰的订书钉链以及脚手架链混合后加入缓冲液，放入PCR仪中，一定退火温度下发生DNA折纸自组装后，用超滤的方法去除多余的订书钉链，即得所述DNA折纸。其中所述缓冲液为本领域常规缓冲液，优选地为IXTAE/Mg2+缓冲液体系。其中所述退火温度较佳地为从95°C退火至20°C，退火速度较佳地为O. rc /10秒；其中所述的脚手架链较佳地为基因组DNA，优选地为M13mpl8DNA。脚手架链与订书钉单链按摩尔比较佳地为1:10 1:5，优选地为1:10。所述的脚手架链，是一种成熟的商业化产品，也可采用常规基因工程方法获得。其中所述的DNA折纸为本领域常规所述DNA折纸。所述的DNA折纸的图案可根据需要设计成不同图案。本专利技术中所述DNA折纸较佳地为二维DNA折纸。所述二维DNA折纸图案优选地为IOOnmX 70nm的矩形图案。其中步骤(2)所述的反应物I和反应物II反应达到平衡后，就可通过AFM成像在DNA折纸反应物I修饰的位置观察到高度的变化。所述反应平衡的温度优选地为37°C。只要通过比较AFM图像中DNA折纸上设计的反应物I的位点数N，与AFM图像中结合有反应物II的反应物I的位点数η,则(η/Ν)就是反应到达平衡时反应物I和反应物II的结合率。因此，可通过计数的方法获取反应平衡常数值，该方法是真正在单分子水平上对生物分子亲和性特征进行研究的技术方法。其中所述的原子力显微镜(AFM)成像方法为本领域常规原子力显微镜成像方法。所述原子力显微镜成像方法较佳地包括以下步骤将反应完毕的溶液滴加于云母片上进行吸附，将吸附完毕的云母片放置于注有缓冲液的液体槽中，置于原子力显微镜下，于液相轻敲模式进行扫描成像操作。其中所述吸附方法为本领域常规吸附方法。所述吸附方法较佳地包括以下步骤将云母片用双面胶粘于铁片上，把反应完毕的溶液样品滴在云母衬底上，吸附几分钟之后即可置于盛有缓冲液的液体槽中，在原子力显微镜(AFM)上进行成像。其中所述的云母衬底为本领域常规云母衬底，其较佳地包括用APTES (3-胺基丙基-三乙氧基硅烷)修饰的云母片、用镍离子修饰的云母片或新解离的云母片，本专利技术优选新解离的云母片。其中所述吸附的时间较佳地为2 5分钟，优选地为5分钟。其中所述的反应完毕的溶液样品的用量为本领域AFM检测常规用量。所述样品的用量较佳地为> IyL并且< 10yL，优选地为 2 μ L。其中所述AFM成像的温度较佳地为20 37°C，优选地为25°C。其中所述的缓冲液为本领域常规缓冲液，本专利技术优选I X TAE/Mg2+缓冲液(所述缓冲液的配方为 Tris 30 40mM，乙酸 10 20mM，EDTA I 2mM，MgCl2IO 12. 5mM, 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DNA折纸的生物分子的亲和常数测定方法，其特征在于，所述生物分子包括能够彼此结合与解离的反应物Ⅰ和反应物Ⅱ，该测定方法包括以下步骤：（1）将反应物Ⅰ连接于DNA折纸订书钉链末端，然后和脚手架链自组装形成DNA折纸；（2）加入反应物Ⅱ，反应达到平衡后利用原子力显微镜扫描成像收集数据，计算出反应物I和反应物Ⅱ复合物的浓度[AbAg]，游离的反应物Ⅰ的浓度[Ag]以及游离的反应物Ⅱ的浓度[Ab]；（3）将步骤（2）所得数值代入如下公式，K＝[AbAg]/[Ag][Ab]，计算得到所述反应物Ⅰ和反应物Ⅱ的亲和常数K。

【技术特征摘要】
书所限定的范围。权利要求1.一种基于DNA折纸的生物分子的亲和常数測定方法，其特征在干，所述生物分子包括能够彼此结合与解离的反应物I和反应物II，该测定方法包括以下步骤 (1)将反应物I连接于DNA折纸订书钉链末端，然后和脚手架链自组装形成DNA折纸； (2)加入反应物II，反应达到平衡后利用原子力显微镜扫描成像收集数据，计算出反应物I和反应物II复合物的浓度[AbAg]，游离的反应物I的浓度[Ag]以及游离的反应物II的浓度[Ab]； (3)将步骤(2)所得数值代入如下公式，K= [AbAg]/[Ag] [Ab]，计算得到所述反应物I和反应物II的亲和常数K。2.如权利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述反应物I和反应物II包括抗原和抗体，生物素和亲和素，核酸适配体及其靶分子以及配体和受体中的ー组或几组。3.如权利要求2所述的測定方法，其特征在于，所述反应物I和反应物II是地高辛和地高辛抗体。4.如权利要求I所述的測定方法，其特征在于，步骤(I)所述订书钉链和脚手架链自组装形成DNA折纸包括将脚手架链与订书钉链混合后置于1XTAE/Mg2+缓冲液体系，其中所述订书钉链的末端连接有反应物...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊友杰，李宾，吴娜，胡钧，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：