本发明专利技术涉及用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ?ID?No.1-5所示。本发明专利技术还涉及用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD检测试剂盒，所述试剂盒包含本发明专利技术所述的引物。本发明专利技术还涉及用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法，所述方法包括使用本发明专利技术所述的引物或试剂盒。本发明专利技术还涉及本发明专利技术所述的引物或试剂盒在检测啤酒大麦品种和/或纯度中的应用。使用本发明专利技术的RAPD方法，能够快速进行啤酒大麦品种和/或纯度的检测，且操作简便，结果可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物、用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的试剂盒、使用所述引物或试剂盒检测啤酒大麦品种和/或纯度的方法，以及所述引物或试剂盒在检测啤酒大麦品种和/或纯度中的应用。
技术介绍
大麦是仅次于水稻、小麦、玉米等粮食作物的第四大主产作物，根据其用途可分为啤酒大麦、饲用大麦、食用大麦三种类型。其中啤酒大麦是啤酒酿造的主要来源。目前我国啤酒大麦种植面积约1000万亩，年产约150-200万吨，优质啤酒大麦产量远远达不到市场需求，据统计1998-2007年我国从澳大利亚、加拿大、法国共计进口 1834. I万吨啤酒大麦，年均进口量183万吨。近年来，由于啤酒工业的迅猛发展，对啤酒大麦的需求不断增大，同 时对其品质要求也随之提高。啤酒大麦种质的优劣将直接影响麦芽和啤酒品质。因各地风土气候和耕种习惯等原因，世界各地不同品系、不同产地的啤酒大麦各不相同，酿造出的啤酒质量也大相径庭。啤酒大麦品种和/或纯度是评判啤酒大麦质量的重要指标，准确鉴别啤酒大麦品种和/或纯度是啤酒大麦原料质量控制的重要措施。目前，由于生产、经营、管理不规范，不合格种子甚至假种频繁混入市场，对啤酒工业造成了一定损失，并损害了品种权拥有者的利益和广大农民的经济利益，破坏了良好的市场秩序。因此，建立一套完善的种质鉴定体系尤为重要。目前，传统的鉴定手段多采用形态标记方法，如穗长、粒色、干粒重等，但该法易受环境及杂交过程个体变化影响，鉴定结果不可靠。在啤酒大麦种质鉴定方面寻求可靠的分子生物学技术成为一种趋势。RAPD (随机扩增多态DNA)技术作为一种DNA分子指纹技术，是利用合成的随机引物基于整个基因组序列进行随机PCR扩增，不同的基因组由于序列的差异导致PCR产物长度多态性，通过电泳检测到的多态性特征对不同基因组进行区分，十分容易发现不同样品之间的序列差异。因此，RAPD在物种鉴定中的优势非常突出，不仅操作相对简便，容易标准化，而且是从基因水平进行分析，不受外界条件的影响，分辨率高，可有效区分近缘品种。目前，国内外对于检测啤酒大麦的品种和/或纯度的RAPD方法研究较少，而且技术尚不够成熟，尤其是对于啤酒大麦的纯度检测尚无直接根据扩增条带进行半定量的先例。另外，传统的啤酒大麦RAro检测技术是通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行PCR产物的检测，例如“侯永翠等，利用RAPD标记分析大麦种质资源的遗传多样性,《植物遗传资源学报》2005,6 (2) 145 150”和“张大乐等，中国啤酒大麦品种RAPD标记的遗传多样性分析，《武汉植物学研究》2005，23(4) 305 309”中所揭示的，通过肉眼观察分子量标准对应位置来判断标记条带的有无，容易受到电泳条件变化或操作误差造成的条带位置偏差的干扰，加上随机扩增自身的非特异性，得到的图谱往往在重现性上存在问题。另外，目前针对啤酒大麦之类的谷物纯度的基因鉴别方法主要采用单粒法，操作繁琐，需要投入大量人力物力。因此，本领域需要一种快速、简便以及可靠的啤酒大麦品种和/或纯度的检测方法。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供了用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No. 1-5所示。 本专利技术所述引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. I(Opp14) :5，CCAGCCGAAC3，；SEQ ID No. 2 (BA8) :5，GTCCACACGG3，；SEQ ID No. 3 (BAlO) :5，CTGCTGGGAC3，；SEQ ID No. 4(BA152) :5，TTATCGCCCC3，;以及SEQ ID No. 5(BA187) :5，TCCGATGCTG3，。另一方面，本专利技术提供了用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术所述的引物。根据一种优选的实施方式，本专利技术的所述试剂盒还包含使用说明书，所述使用说明书中记载的随机PCR扩增反应条件是94°C, IOmin ；94°C lmin, 37°C lmin, 72°C 2min，45个循环；72°C 5min。根据一种优选的实施方式，本专利技术的所述试剂盒还包含用于提取样品DNA的试剂和用于随机PCR扩增反应的试剂。根据一种进一步优选的实施方式，所述试剂盒还包含标准品和阴性对照，所述标准品为啤酒大麦目标品系的DNA序列，所述阴性对照为无菌双蒸水。再一方面，本专利技术提供了用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法，所述方法包括使用本专利技术所述的引物或试剂盒。根据一种实施方式，本专利技术用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法包括如下步骤；(I)提取啤酒大麦DNA模板；(2)分别使用本专利技术所述的引物对于所述步骤⑴获得的啤酒大麦DNA模板进行随机PCR扩增；(3)对所述步骤(2)随机PCR扩增获得的产物进行毛细管芯片电泳；(4)根据所述步骤(3)获得的标志带图谱鉴定啤酒大麦的品种；和/或(5)对于所述步骤(3)获得的标志带图谱绘制标准曲线，建立啤酒大麦纯度检测半定量模型，以判定啤酒大麦目标品种的纯度。根据一种优选实施方式，其中，上述步骤(2)的随机PCR扩增的条件被设定为94°C, IOmin ；94°C lmin,37°C lmin,72°C 2min，45 个循环；72°C 5min。根据一种优选实施方式，本专利技术用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法能够鉴定选自下述的啤酒大麦品种甘啤3号、甘啤4号、恳啤2号、恳啤3号、Harningtan,Copeland、Metcalfe、Baudlin、Hamel in Λ Legacy、Kendall、Stirling、Gairdner Λ Estevel、Cervoise、Flagship、Arturio、Vlamingh 以及 Newdale。根据一种优选实施方式，其中，上述步骤(3)中毛细管芯片电泳釆用50_1000bp分子量标准品。又一方面，本专利技术提供了本专利技术所述的引物或试剂盒在检测啤酒大麦品种和/或纯度中的应用。本专利技术RAPD技术通过使用本专利技术人筛选的5条随机寡核苷酸引物并利用毛细管芯片电泳对PCR产物高分辨、高灵敏度、稳定以及准确量化(分子量、相对量以及浓度)的优点，对初选得到的随机扩增标志带的重现性进行严格筛查，最终得到7条有意义的标志带。结果证明，利用本专利技术建立的RAro检测方法可以有效地进行啤酒大麦品种的鉴定，同时还通过标准曲线方法建立啤酒大麦纯度快速检测半定量模型，从而可对啤酒大麦样品纯度进行准确的半定量检测。该半定量方法直接对混合样品进行检测，无需对大量的单粒种子分别进行鉴别，可以迅速判断样品的纯度范围，使得操作更为简便。本专利技术的RAPD技术快速、简便且可靠，具有良好的应用推广前景。附图说明·图I显示不同扩增酶反应体系对7个标志带的灵敏度影响情况。这里使用的扩增酶反应体系包括Hotstar、Takara> Invitrogen。灵敏度表示为模板的10倍倍比系列稀释倍数，倍数越高，说明灵敏度越高。横坐标为标志带，纵坐标为稀释倍数。图2是19号和I号组合(图2A)、14号和3号组合(图2B)、11号和8号组合(图2C)的啤酒大麦不同比例混合物(基于I号、1本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为SEQ?ID?No.1?5所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴亚君，陈颖，王斌，韩建勋，袁飞，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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