本发明专利技术公开了一组黄曲霉毒素B2的寡核苷酸适配子。通过SELEX技术获得了能够特异识别黄曲霉毒素B2的单链DNA寡核苷酸适配子，该适配子可以通过荧光素标记等转为报告适配子用于检测黄曲霉毒素B2，该适配子序列在准确、快速检出食品中的黄曲霉毒素B2方面具有广泛应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一组与黄曲霉毒素B2高特异性和高亲和力的核酸适配子，为该核酸适配子在检测黄曲霉毒素B2中的应用提供科学依据和理论基础。
技术介绍
黄曲霉毒素(aflatoxins，AF)主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代谢产物，其化学结构类似，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。目前已确定黄曲霉毒素结构的有AFBpAFB2、AFM1等18种，它们的基本结构中都含有二呋喃环和氧杂萘邻酮(又名香豆素)，前者为其毒性结构，后者可能与其致癌有关。黄曲霉毒素耐高温，通常加热处理对其破坏很小，只有在熔点温度下才发生分解。黄曲霉毒素遇碱能迅速分解，但此反应可逆，即在酸性条件下又复原。在温暖潮湿气候地区的粮食和饲料，凡被黄曲霉菌和寄生曲霉菌污染都可能存在黄曲霉毒素。黄曲霉毒素最易污染花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯，大豆柏被黄曲霉毒素污染的程度轻些。我国粮食和饲料被黄曲毒素污染率很高，给饲料企业和养殖业主带来了很大损失。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素B2与黄曲霉毒素B1结构极其相似，只差一个双键的位置，鉴于黄曲霉毒素B1的强致癌性与毒性，黄曲霉毒素B2也具有其性质，因此，如何快速、准确检测出黄曲霉毒素B2具有重要研究意义。目前，对真菌毒素B2的检测方法应用最多的是抗原抗体法即免疫学方法，但这种方法需要制备特异性的抗体，抗体具有不稳定性，制备的成本较高而且不宜保存，受免疫原性等的限制。这些不足制约了免疫学方法在真菌毒素领域中的应用。而且目前存在的检测方法检测限普遍较高，不适合真菌毒素中毒具有隐蔽性和微量性的特点。因此，建立新的对真菌毒素尤其是黄曲霉毒素B2为典型代表的快速而灵敏的检测方法尤为必要。近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX 技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研究核酸结构和功能的有效方法。其基本原理是体外化学合成一个随机单链寡核苷酸库，与靶物质混合孵育，形成靶物质-核酸复合物，洗去未与靶物质结合的核酸分子，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的筛选过程。通过数轮重复筛选与扩增，最后得到高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，即Aptamer。利用SELEX技术筛选获得的Aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，适配子具有更明显的优越性，如不依赖动物细胞，不受免疫条件和免疫原性限制，适配子的筛选完全在体外进行，具有时间、质量和数量上的选择弹性，可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子；适配子变性与复性可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输；靶分子范围更广，除蛋白质、核苷酸大分子外，还有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶碱等)、生长因子、肽链、类固醇、糖类、辅因子(如FMN等)，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子等；与靶分子结合具有更强的特异性和亲和力，不受组织或样品中非靶蛋白的干扰，可以在靶目标性质未知的情况下筛选出其相应的适配子；适配子通过占据靶物质表位，使疾病得到控制，作为临床药物的治疗，已显现了潜在的应用前景，已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，抑制肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、ー些毒素蛋白等的作用，以达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对ー些致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。鉴于SELEX技术相对于传统抗原抗体技术的优势，具有更高的选择性，特异性和亲和性，以及能区分结构极其相似的物质的特性，而且目前SELEX技术主要应用在整体菌及细胞等大分子的筛选中，在小分子领域尤其是真菌毒素的应用中很少，据报道筛选出的 真菌毒素适配体只有赭曲霉毒素和伏马菌素的适配子，若能筛选出黄曲霉毒素B2的适配子对真菌毒素的检测将有重要的意义，同时也将推动SELEX技术在小分子领域的发展，也是SELEX技术自身的完善。本专利技术以食品和粮食中常见的黄曲霉毒素B2为靶标，利用SELEX技术获得了与黄曲霉毒素B2特异性结合的核酸适配子序列，该序列可以快速、准确检测黄曲霉毒素B2,由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测黄曲霉毒素B2，因此操作简单、直接。该专利技术可以在食品安全检测、临床医学等领域得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供ー种真菌毒素检测方法，特别涉及ー种利用适配子技术快速、准确检测黄曲霉毒素B2的方法。本专利技术方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以黄曲霉毒素B2为靶标，筛选获得与靶标高亲和性特异结合的适配子，通过羧基荧光素(FAM)标记方法达到快速、准确诊断食品或粮食中黄曲霉毒素B2的目的。本专利技术的优点(I)与蛋白类的抗体相比，单链寡核苷酸更为稳定；Aptamer可直接体外合成、标记，不需要标记的ニ抗，使得操作更为简单、迅速;Aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。(2)该序列是从结构显著、与靶标具有不同亲和カ的9条适配子序列中选取出的亲和カ和特异性均最強的一组适配子序列，能够特异识别黄曲霉毒素B2。附图说明图I是第ト10轮筛选得到的AFb2-SSDNA变性聚丙烯酰胺电泳2是AFB2_aptamer饱和结合曲线3 是 AFB2_aptamer 特异性图表I代表适配子与AFB2的解离常数具体实施例方式下面是通过SELEX技术筛选特异结合部分适配子与AFB2的解离常数的核酸适配子制备方法及其快速检出部分适配子与AFB2的解离常数方面的应用。I、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)随机单链DNA(ssDNA)文库5’ -AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG (N40) CCT ATGCGTGCT ACC GTG AA-3’，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量为1014以上；引物I :5’ -AGCAGCACAGAG GTCAGATG-3’ ；引物II :5’ -PO4-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3’，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100 μ mol/L贮存液_20°C贮存备用。2、双链 DNA (dsDNA)及单链 DNA (ssDNA)文库的 PCR 扩增 取2nmol随机ssDNA文库(第二轮开始每次加入200pmol)加入500 μ L结合缓冲液ΒΒ(ρΗ7· O :100mmol/L 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组特异识别黄曲霉毒素B2的寡核苷酸适配子，其寡核苷酸序列为：1)序列表中序列1、2、3所示的序列；2)序列表中序列1所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有序列表中序列1同等功能的序列；3)序列表中序列2所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有序列表中序列2同等功能的序列；4)序列表中序列3所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有序列表中序列3同等功能的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，王文凤，段诺，吴世嘉，夏雨，马小媛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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