本发明专利技术涉及一种新型腈水解酶及其基因的克隆和表达。从恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）XY4（编号CGMCC?No.3830）的总DNA获得腈水解酶基因SEQ?ID?NO:1，该基因全长1113个核苷酸，编码370个氨基酸SEQ?ID?NO:2。本发明专利技术还公开了重组腈水解酶的构建、高效表达和纯化的方法，以及纯化重组腈水解酶的最适作用温度和pH。以质粒pET28a(+)为表达载体，以E.coliRosetta-gami(DE3)为表达宿主，实现腈水解酶基因的高效表达。重组腈水解酶最适作用温度为55℃，最适作用pH为7.5，能高效转化3-氰基吡啶为烟酸，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及源自恶臭假单胞菌iPsGudomorms put i da ) XY4 (保藏编号CGMCCNo. 3830)的一种新型腈水解酶的基因序列，以及腈水解酶工程菌的构建、重组腈水解酶的高效表达和分离纯化，属于酶基因工程及酶工程领域。
技术介绍
腈水解酶能够催化腈类化合物转化为具有广泛应用价值的羧酸类化合物，如丙烯酸、扁桃酸、烟酸、异烟酸、亚氨基二乙酸、甘氨酸等。同时该酶可以用于处理含有腈的废水和腈污染的有毒废水。腈水解酶作用底物的广泛性及优良的化学、区域、立体选择性使其在羧酸合成中表现出巨大应用潜力，在制药、饲料、食品、环保等领域具有良好的应用前景。 烟酸，又称为3-吡啶甲酸，是人体必需的13种维生素之一，广泛应用于食品和饲料添加剂。烟酸作为药物除了能够治疗糙皮病外，还可以用于治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、糖尿病等。另外烟酸可作为形成活性污泥的生化激素、空气和废气的除臭剂。烟酸在染料、感光材料、洗涤剂等方面也有一定的应用。烟酸的生产可采用化学方法和生物方法合成，目前在工业上，仍主要采用化学法来进行烟酸的生产，如氨氧化法、气相氧化法、电解氧化法和吡啶羟基化法等，所采用原料一般为3-甲基吡唆、2-甲基-5-乙基吡唆、3-氰基吡啶以及哇琳等。如专利CN200810058492. 4公开了以吡啶为溶剂，二氧化硒为氧化剂，3-甲基吡啶为原料合成烟酸的方法，反应温度为10(Tl50 °C，反应选择性在98. 5%以上，但产品收率仅4(Γ50%。专利CN95191372. 7公开了以3-甲基吡啶为原料，在钒、钛氧化物催化剂存在下，按氧3-甲基吡啶摩尔比15 40，水3-甲基吡啶摩尔比1(Γ70条件下进行一步气相非均相催化氧化反应，烟酸收率为82 86%，但该法反应温度250-290°C，对设备要求较高，能耗较大，而且收率偏低。从这些情况可以看出，化学合成法产率较低，产品副产物较多，需采用价格昂贵的催化剂，产品的后续分离纯化困难，而且能耗偏高，污染较严重。因此，化学法应用于烟酸制备仍存在诸多不足之处。相对于传统化学方法，生物催化法反应条件温和，环境友好，催化剂易于制备，催化效率较高，选择性强且成本较低，适合于工业化生产，为烟酸的大规模制备提供了一条行之有效的途径。自1988年,Mathew等采用能产腈水解酶的菌株TSotZococciAs rhodochrousJI催化3-氰基吡啶合成烟酸，此后陆续报道能产腈水解酶的菌株Λ rhodochrousLL100-21> Rhodococcus sp> Bacillus pallidus Dac521 > Nocardia globerula NHB—2、Rhodococcus sp. NDB 1165 > Rhodobacter sphaeroides LHS-305 等微生物的游离细胞或固定化细胞被应用于催化3-氰基吡啶合成烟酸。为了进一步提高催化剂的稳定性及催化效率，同时为深入了解腈水解酶的分子机理，很多研究者对野生菌腈水解酶的基因进行克隆表达。但是应用于催化3-氰基吡啶转化为烟酸的野生菌的腈水解酶基因的克隆、表达、酶学性质报导不多。目前国内没有对恶臭假单胞菌腈水解酶基因的克隆、表达的研究。恶臭假单胞菌putida') XY4 (保藏编号CGMCC No. 3830)为本实验室筛选到的一株具有腈水解酶活性的菌株，能够催化3-氰基吡啶产烟酸。此外，恶臭假单胞菌(.Pseudomonas putida ) (保藏编号CGMCC No. 3830)所产的腈水解酶还能够转化4-氰基吡唆、2-氯-4氰基吡啶、亚氨基二乙腈、氰基吡嗪、甘氨腈等腈类化合物产生相应的酸。因此恶臭假单胞菌putida) IYA (保藏编号CGMCC No. 3830)腈水解酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达，为其实际应用及作用机理研究显得非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的腈水解酶及其基因的克隆方法，该腈水解酶由SEQID :2所不的氣基酸序列构成，由SEQ ID :I所不的基因序列编码。该臆水解酶由一株恶臭假单胞菌产生，该株恶臭假单胞菌于2010年5月11日保藏在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3830，分类命名为恶臭假单胞菌putida)TiA0本专利技术的另一个目的是提供包含本专利技术基因的质粒及包含本表达质粒的宿主细胞。 为了实现本专利技术的技术目的，本专利技术的技术方案在于 I、所述的腈水解酶完整基因序列的克隆方法。(I)恶臭假单胞菌putidaYHA (保藏编号 CGMCC No. 3830)腈水解酶基因部分序列(Nit M)的克隆将属腈水解酶氨基酸序列进行同源比对,采用C0DEH0P软件进行引物设计，经DNAMAN软件进一步分析，设计一对简并引物Pl和P2，以恶臭假单胞菌putida') XY4 (保藏编号CGMCC No. 3830)总DNA为模板克隆Nit M序列Pl: 5’ -GGGGGMGCTGaarccnacnca-3’P2: 5， -ACGTCGGGCCTGswrtartgncc-3’ PCR反应在50 μ L体系中进行，反应条件为95°C预变性5 min ；94 °C变性30 s, 55-65°C退火40 s,72 °C延伸40 S，共30个循环；72 °C终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与PMD19-T载体连接后转化大肠杆菌(Bscherichia coli) JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上。经37 1培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，以Pl和P2为引物PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定。(2)恶臭假单胞菌/7Wiii/a)XY4 (保藏编号 CGMCC No. 3830)腈水解酶基因5’端序列(Nit 5’)的克隆根据分离纯化恶臭假单胞菌(Aewi/offioftas putida)Ti^(保藏编号CGMCC No. 3830)所产腈水解酶测得的N端序列设计简并引物P3，根据上述得到的Nit M序列设计引物P4,以恶臭假单胞菌(Aewt/offlmas putida) XY4 (保藏编号CGMCCNo. 3830)总DNA为模板克隆Nit 5，端序列P3: 5， -ATGGTRACATAYACNAAYAA-3’P4: 5’ - TCTACATGCGTCGGCTTCAGCTT-3’ PCR反应在50 μ L体系中进行，反应条件为95 °C预变性5 min ；94 °C变性30 s, 50-60°C退火40 s,72 °C延伸40 S，共30个循环；72 °C终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD-19 T载体连接后转化疋coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上。经37 °C培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，以P3和P4为引物PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定。(3)恶臭假单胞菌putidaYHA (保藏编号 CGM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于恶臭假单胞菌（Pseudomonas？putida）XY4（编号CGMCC3830）的新型腈水解酶，其完整的DNA序列和氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许正宏，朱小燕，李恒，史劲松，龚劲松，钱建瑛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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